本文關(guān)鍵詞：新型人源化抗CD20單克隆抗體的表達(dá)和活性檢測，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：B細(xì)胞淋巴瘤是發(fā)生在B細(xì)胞的實體腫瘤,主要可以分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma, NHL). NHL在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中十分常見,對人類生命健康造成極其嚴(yán)重的威脅。但到目前為止,臨床上傳統(tǒng)的化療藥物對NHL的治療效果并不理想,科學(xué)家正在研發(fā)各種新型藥物來治療NHL。單克隆抗體因為其高特異性和靶向性而發(fā)展迅速。B淋巴細(xì)胞抗原CD20是人類B淋巴細(xì)胞表面上所特有的標(biāo)識,主要由297個氨基酸構(gòu)成。根據(jù)不同的磷酸化水平,CD20的分子量為33-37kD,屬于非糖基化磷蛋白。CD20分子是一種有四個跨膜區(qū)的跨膜蛋白,它的N端和C端都位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)側(cè)。CD20分子的主要抗原表位位于第三、四跨膜區(qū)之間,是一個由43個氨基酸組成的環(huán)狀區(qū)域。從前體B細(xì)胞到后來的分化過程,CD20廣泛表達(dá)于B細(xì)胞的表面,但是不表達(dá)于晚期分化的漿細(xì)胞中。CD20表達(dá)于B細(xì)胞發(fā)展的除了最初和最后以外的所有階段。CD20在B細(xì)胞淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病和黑色素瘤腫瘤干細(xì)胞中均被發(fā)現(xiàn)。CD20分子位于B細(xì)胞膜表面,抗體接近的空間位阻較小,因此CD20分子成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶點。雖然CD20的功能尚未完全清楚,但是它在Ca2+跨膜傳遞,維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+聚集和B細(xì)胞激活方面發(fā)揮著重要作用。 Rituximab是一種與B細(xì)胞表面CD20分子特異性結(jié)合的人/鼠嵌合型單克隆抗體。Rituximab是一種糖基化IgGlK免疫球蛋白,其中鼠源來自于鼠抗CD20單抗的可變區(qū)Fab段,人源來自于人IgGl抗體穩(wěn)定區(qū)Fc段。Rituximab由1328個氨基酸組成,分子量約為144Kd。 Rituximab由IDEC公司研發(fā),藥品名稱是IDEC-C2B8。因為Rituximab具有殺傷B細(xì)胞的功能因此被用于治療以B細(xì)胞過量表達(dá),B細(xì)胞過度活化或B細(xì)胞功能失調(diào)為特點的相關(guān)疾病,例如：白血病、淋巴瘤、移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病。基于其臨床試驗中顯示的安全性和有效性,美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)在1997年批準(zhǔn)Rituximab用于治療對于其他化療方案無效的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。2010年歐盟委員會批準(zhǔn)Rituximab用于濾泡性淋巴瘤初始治療后的維持治療。在三組隨機對照試驗中,Rituximab已經(jīng)被證明是一種有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物,現(xiàn)在已經(jīng)批準(zhǔn)用于難治愈型類風(fēng)濕性疾病的治療。美國FDA批準(zhǔn)Rituximab與甲氨蝶呤(MTX)聯(lián)合用于治療對抗TNFa治療反應(yīng)不足的中度至嚴(yán)重活動性成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。在歐洲,Rituximab僅被批準(zhǔn)與甲氨蝶呤聯(lián)合治療抗TNFa治療反應(yīng)不足的嚴(yán)重活動性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。其他Rituximab治療的自身免疫性疾病包括：自身免疫性溶血性貧血、純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、埃文斯綜合癥、血管炎、大皰的皮膚疾病、Ⅰ型糖尿病、干燥綜合征、德維克病和Graves眼病等。 Rituximab是一種人鼠嵌合型的抗CD20單克隆抗體,具有30%左右的鼠源蛋白,因此長期使用會引起免疫原性。因此,尋求更為有效的抗CD20抗體用于B淋巴瘤的治療顯得尤為迫切。 我們通過計算機模建技術(shù),在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中找到與Rituximab空間結(jié)構(gòu)最相近的人IgG1為骨架,將Rituximab的CDR區(qū)進行移植和改造,通過重疊PCR方法,擴增出目的基因片段。分別將輕、重鏈基因片段克隆到載體pcDNA3.3. Poptivec質(zhì)粒上。瞬時轉(zhuǎn)染至293F細(xì)胞,收取細(xì)胞上清,用rProteinA親和層析法純化目的抗體,并用SDS-PAGE檢驗抗體的表達(dá)量,采用Fortebio技術(shù)檢測抗體與抗原的結(jié)合能力,最后進行裸鼠移植瘤生長抑制實驗以檢驗抗體的抗腫瘤活性。結(jié)果顯示：抗體的輕、重鏈質(zhì)粒已經(jīng)被成功構(gòu)建,并且順利的轉(zhuǎn)染和表達(dá),最終純化得到13種目的抗CD20人源化抗體。抗體在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為相對分子質(zhì)量約為25Kd和55Kd兩條帶,與預(yù)計條帶大小相符；Fortebio實驗結(jié)果表明,13組抗體與抗原具有良好的親和活性,其中：L4H7抗體的Kd值為1.91x10-9mol/L、L5H5抗體的Kd值為7.35x10-10mol/L、L5H7抗體的Kd值為1.91×10-9mol/L。裸鼠移植瘤生長抑制實驗表明,L5H7抗體的抗腫瘤活性優(yōu)于Rituximab。下一步,我們將增加實驗動物的數(shù)量,進一步驗證抗體L5H7的抗腫瘤活性和安全性,以期獲得親和力更強,抗腫瘤活性更高并且副作用更少的安全有效的人源化抗CD20單克隆抗體,為臨床上NHL的有效治療提供了新的手段。
【關(guān)鍵詞】：CD20 人源化 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 縮略詞表10-11
• 引言11-22
• 1 惡性淋巴瘤11-17
• 1.1 背景11
• 1.2 分類11-12
• 1.3 病因12-13
• 1.4 臨床癥狀13-15
• 1.5 檢查和診斷方法15-16
• 1.6 分期16
• 1.7 治療手段16-17
• 2 抗CD20單克隆抗體藥物17-20
• 2.1 第一代抗CD20治療性單克隆抗體藥物17-18
• 2.2 第二代抗CD20治療性單克隆抗體藥物18-19
• 2.3 第三代抗CD20治療性單克隆抗體藥物19-20
• 3 研究目的意義20-22
• 第二部分 材料與方法22-37
• 1 材料22-26
• 1.1 細(xì)胞株及實驗動物22
• 1.2 菌株及質(zhì)粒22
• 1.3 工具酶及抗體22
• 1.4 試劑及試劑盒22
• 1.5 培養(yǎng)基22-23
• 1.6 耗材23
• 1.7 緩沖液23-24
• 1.8 主要儀器設(shè)備24-26
• 2. 實驗方法26-37
• 2.1 構(gòu)建CD20-L、CD20-H克隆26-29
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存與轉(zhuǎn)染29-31
• 2.3 蛋白質(zhì)的純化濃縮31-32
• 2.4 SDS-PAGE電泳32
• 2.5 考馬斯亮藍(lán)染色32-33
• 2.6 Fortebio測親和力33
• 2.7 抗體的體外功能研究33-35
• 2.8 裸鼠移植瘤生長抑制試驗35-37
• 第三部分 結(jié)果37-55
• 3.1 抗體基因片段的克隆37-47
• 3.1.1 引物的設(shè)計與合成37-46
• 3.1.2 pMD18-T-L和pMD18-T-H質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定46-47
• 3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建47-49
• 3.3 抗體的表達(dá)純化和鑒定49-52
• 3.3.1 抗體的表達(dá)和純化49-51
• 3.3.2 抗體的還原/非原聚丙烯酰胺凝膠電泳51-52
• 3.4 抗體的抗體結(jié)合活性的Fortebio檢測52-53
• 3.5 抗體的體外功能研究53-54
• 3.5.1 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)53
• 3.5.2 補體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)53-54
• 3.6 裸鼠移植瘤生長抑制實驗結(jié)果54-55
• 4 總結(jié)55-56
• 4.1 本研究主要獲得的結(jié)果55
• 4.2 本研究的創(chuàng)新之處55
• 4.3 需進一步研究的問題55-56
• 討論56-57
• 參考文獻57-62
• 致謝62-63
• 碩士期間發(fā)表論文63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 梁進;申政磊;畢清;;吉西他濱聯(lián)合順鉑和地塞米松治療復(fù)發(fā)或難治性非霍奇金淋巴瘤30例療效觀察[J];海南醫(yī)學(xué);2009年S2期

2 李愛玲,孫瑛勛,洪海燕,于鳴,趙法O,郭俊生,沈倍奮;利用基因重組抗原研制人CD20單克隆抗體及其功能的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2002年04期

  本文關(guān)鍵詞：新型人源化抗CD20單克隆抗體的表達(dá)和活性檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：351686