本文關(guān)鍵詞：檢查點(diǎn)激酶Rad3和Rad17在重組修復(fù)中作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因損傷修復(fù)常與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。酵母作為單細(xì)胞的真核生物,是基因損傷修復(fù)機(jī)制研究的良好材料。在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中,Rad3是監(jiān)控DNA能否正常復(fù)制,決定細(xì)胞能否進(jìn)入M期的S/G2期檢查點(diǎn)激酶蛋白。基因損傷可激活該蛋白,并阻止細(xì)胞停留在S/G2期,直至基因組修復(fù)完成。Rad17同樣為細(xì)胞周期S/G2檢查點(diǎn)蛋白,在基因損傷時(shí),該蛋白具有募集并引導(dǎo)9-1-1(RAD1-RAD9-HUS1)復(fù)合物在染色質(zhì)上形成環(huán)型夾鉗,同樣阻止DNA錯(cuò)誤復(fù)制并促使DNA進(jìn)行修復(fù)。研究Rad3和Rad17在基因損傷后修復(fù)機(jī)制中的作用對(duì)于探究癌癥發(fā)生與癌癥治療具有重要價(jià)值。 在酵母的mat1位點(diǎn)旁側(cè),存在著一個(gè)影響DNA復(fù)制的特殊序列RTS1(replication termination sequence1),該序列與Rtf1(replication termination factor1)蛋白結(jié)合后,可阻止朝向中心粒的DNA單向復(fù)制,從而引起DNA鏈的斷裂和隨后的同源重組,參與酵母的交配型轉(zhuǎn)變。在同源重組的建立過(guò)程中,Exo1、Rad22、RPA和Rhp51四種蛋白發(fā)揮著重要作用。研究表明,利用RTS1和Rft1的復(fù)制單向通過(guò)機(jī)制可以用于同源重組修復(fù)機(jī)理的研究。因此,本論文采用了一個(gè)uraR系統(tǒng),該系統(tǒng)包含一個(gè)復(fù)制終止序列RTS1,一個(gè)檢測(cè)基因ura4,和一個(gè)添加有受硫胺素調(diào)控啟動(dòng)子nmt41的rf1基因所組成。通過(guò)硫胺素調(diào)節(jié),對(duì)上述兩檢測(cè)點(diǎn)蛋白R(shí)ad3和Rad17在復(fù)制受阻條件下,對(duì)同源重組蛋白R(shí)ad22,RPA,Rhp51和Exol在基因ura4兩側(cè)的募集水平進(jìn)行了檢測(cè),以闡明檢測(cè)點(diǎn)蛋白在酵母同源重組修復(fù)中的作用與功能。 本論文首先以rad3、radl7和exol單缺失突變體、含有蛋白標(biāo)簽的rad22、rpa、rhp51、exol和含有uraR系統(tǒng)的裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)菌株為材料,通過(guò)減數(shù)分裂重組(genetic cross)方法構(gòu)建本研究所需的所有菌株,繼而,采用含硫胺素培養(yǎng)基培養(yǎng),隨后去除硫胺素,激活rft1基因表達(dá)并繼續(xù)培養(yǎng),以啟動(dòng)依賴RTS1序列的復(fù)制叉阻滯。菌體經(jīng)離心收集后,采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR,分析Rft1表達(dá)(復(fù)制停止)與不表達(dá)(復(fù)制正常進(jìn)行)兩種狀態(tài)下,Rad22,RPA和Rhp51分別在rad3.d,rad17.d單缺失與rad3.d、rad17.d雙缺失情況下,在uraR區(qū)域的募集情況。結(jié)果表明,在Rtf1表達(dá)條件下,rad3.d缺失菌的Rad22,RPA,Rhp51相對(duì)野生型募集均顯著升高；radl7.d缺失菌的3個(gè)蛋白募集量相比野生型卻嚴(yán)重減少；雙缺失rad3.d, rad17.d菌蛋白募集情況與radl7.d菌結(jié)果相同。顯示出Rad3和Rad17在激發(fā)同源重組中的功能差異。 由于Exo1為核酸外切酶,參與損傷DNA的單鏈剪切,以啟動(dòng)Rad22等后續(xù)蛋白的結(jié)合,因此,采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR,對(duì)其在DNA上的聚集水平進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果極不理想,那么是否可以以Rad22為檢測(cè)對(duì)象,通過(guò)研究Exol缺失狀態(tài)下的募集水平來(lái)反證Exol的活性?為此,依照上述設(shè)想,采用上述方法,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在Rtf1表達(dá)條件下,exol.d缺失菌中的Rad22募集量比野生型明顯減少,該類似結(jié)果同樣發(fā)生在ad3.d、exo1和rad17.d、exo1.d兩種菌株,因而證實(shí)Exol的確參與了同源重組,其功能發(fā)揮切實(shí)與Rad3和Rad17的調(diào)控相關(guān)。 為進(jìn)一步探究Rad3和Rad17對(duì)RTS1所引起的基因重組類型的影響,本論文采用了一個(gè)含有兩個(gè)ade6點(diǎn)突變、一個(gè)完整his+基因和存在于中間的RTSl序列的腺嘌呤缺陷型(.xde6-L469-his+-RTS1-ade6-M3759)重組菌株進(jìn)行檢測(cè)。波動(dòng)實(shí)驗(yàn)(fluctuation test)結(jié)果顯示,在重組菌株中,Rtfl表達(dá)比不表達(dá)所產(chǎn)生的ade6+回復(fù)突變率高出6.9倍；rad3.d缺失后,重組率進(jìn)一步增加至12.5倍,而radl7.d突變僅為基礎(chǔ)水平的3.7倍。依照突變子中his+基因的存在與否,發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的重組類型主要為his+基因缺失的重組突變。 綜合上述研究結(jié)果,可以得出以下結(jié)論：1、對(duì)于Rtf1所引起的復(fù)制停滯,檢查點(diǎn)激酶Rad3抑制重組蛋白R(shí)ad22, Rhp51, RPA募集到RTS1序列,抑制同源重組修復(fù)。與之相反,Rad17促進(jìn)重組蛋白的募集,促進(jìn)同源重組的進(jìn)行。2、Exol在同源重組中起到重要作用,Rad3對(duì)重組蛋白的抑制作用需要Exo1的存在,可能是通過(guò)調(diào)控Exol從而調(diào)節(jié)重組蛋白結(jié)合的單鏈DNA長(zhǎng)度來(lái)起作用。3、通過(guò)重組實(shí)驗(yàn)證明,Rad3抑制同源重組,Rad17促進(jìn)同源重組。
【關(guān)鍵詞】：DNA損傷 復(fù)制叉阻礙 裂殖酵母 檢查點(diǎn) 同源重組修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 1 前言8-16
• 1.1 裂殖酵母8
• 1.2 細(xì)胞周期8-9
• 1.3 細(xì)胞周期檢查點(diǎn)9-11
• 1.4 DNA損傷與修復(fù)11-13
• 1.5 復(fù)制叉與復(fù)制叉阻滯系統(tǒng)13-14
• 1.6 檢查點(diǎn)蛋白調(diào)節(jié)重組修復(fù)14-15
• 1.7 本文的目的15-16
• 2 材料與方法16-21
• 2.1 材料16-18
• 2.2 方法18-21
• 3 結(jié)果21-30
• 3.1 檢查點(diǎn)蛋白對(duì)Rad22募集調(diào)控21-23
• 3.2 檢查點(diǎn)蛋白對(duì)Rhp51募集調(diào)控23-25
• 3.3 檢查點(diǎn)蛋白對(duì)RPA募集調(diào)控25-26
• 3.4 Exol在同源重組修復(fù)中的作用26-28
• 3.5 檢查點(diǎn)蛋白對(duì)直接重組影響28-29
• 3.6 結(jié)論29-30
• 4 討論30-33
• 5 總結(jié)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-37
• 附錄37-42
• 致謝42

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 陳漢春;Rad51同系物與DNA重組修復(fù)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);2003年04期

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3 呂嘉春,吳中亮,施侶元,黎銀燕,曾波航,陳家X;核苷酸切除修復(fù)基因表達(dá)低下與肺癌的關(guān)系[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2003年07期

  本文關(guān)鍵詞：檢查點(diǎn)激酶Rad3和Rad17在重組修復(fù)中作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：351215