本文關鍵詞：檢查點激酶Rad3和Rad17在重組修復中作用機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因損傷修復常與癌癥的發(fā)生密切相關。酵母作為單細胞的真核生物,是基因損傷修復機制研究的良好材料。在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中,Rad3是監(jiān)控DNA能否正常復制,決定細胞能否進入M期的S/G2期檢查點激酶蛋白。基因損傷可激活該蛋白,并阻止細胞停留在S/G2期,直至基因組修復完成。Rad17同樣為細胞周期S/G2檢查點蛋白,在基因損傷時,該蛋白具有募集并引導9-1-1(RAD1-RAD9-HUS1)復合物在染色質上形成環(huán)型夾鉗,同樣阻止DNA錯誤復制并促使DNA進行修復。研究Rad3和Rad17在基因損傷后修復機制中的作用對于探究癌癥發(fā)生與癌癥治療具有重要價值。 在酵母的mat1位點旁側,存在著一個影響DNA復制的特殊序列RTS1(replication termination sequence1),該序列與Rtf1(replication termination factor1)蛋白結合后,可阻止朝向中心粒的DNA單向復制,從而引起DNA鏈的斷裂和隨后的同源重組,參與酵母的交配型轉變。在同源重組的建立過程中,Exo1、Rad22、RPA和Rhp51四種蛋白發(fā)揮著重要作用。研究表明,利用RTS1和Rft1的復制單向通過機制可以用于同源重組修復機理的研究。因此,本論文采用了一個uraR系統(tǒng),該系統(tǒng)包含一個復制終止序列RTS1,一個檢測基因ura4,和一個添加有受硫胺素調(diào)控啟動子nmt41的rf1基因所組成。通過硫胺素調(diào)節(jié),對上述兩檢測點蛋白Rad3和Rad17在復制受阻條件下,對同源重組蛋白Rad22,RPA,Rhp51和Exol在基因ura4兩側的募集水平進行了檢測,以闡明檢測點蛋白在酵母同源重組修復中的作用與功能。 本論文首先以rad3、radl7和exol單缺失突變體、含有蛋白標簽的rad22、rpa、rhp51、exol和含有uraR系統(tǒng)的裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)菌株為材料,通過減數(shù)分裂重組(genetic cross)方法構建本研究所需的所有菌株,繼而,采用含硫胺素培養(yǎng)基培養(yǎng),隨后去除硫胺素,激活rft1基因表達并繼續(xù)培養(yǎng),以啟動依賴RTS1序列的復制叉阻滯。菌體經(jīng)離心收集后,采用染色質免疫共沉淀技術和實時熒光定量PCR,分析Rft1表達(復制停止)與不表達(復制正常進行)兩種狀態(tài)下,Rad22,RPA和Rhp51分別在rad3.d,rad17.d單缺失與rad3.d、rad17.d雙缺失情況下,在uraR區(qū)域的募集情況。結果表明,在Rtf1表達條件下,rad3.d缺失菌的Rad22,RPA,Rhp51相對野生型募集均顯著升高；radl7.d缺失菌的3個蛋白募集量相比野生型卻嚴重減少；雙缺失rad3.d, rad17.d菌蛋白募集情況與radl7.d菌結果相同。顯示出Rad3和Rad17在激發(fā)同源重組中的功能差異。 由于Exo1為核酸外切酶,參與損傷DNA的單鏈剪切,以啟動Rad22等后續(xù)蛋白的結合,因此,采用染色質免疫共沉淀技術和實時熒光定量PCR,對其在DNA上的聚集水平進行檢測的結果極不理想,那么是否可以以Rad22為檢測對象,通過研究Exol缺失狀態(tài)下的募集水平來反證Exol的活性?為此,依照上述設想,采用上述方法,我們的實驗結果顯示：在Rtf1表達條件下,exol.d缺失菌中的Rad22募集量比野生型明顯減少,該類似結果同樣發(fā)生在ad3.d、exo1和rad17.d、exo1.d兩種菌株,因而證實Exol的確參與了同源重組,其功能發(fā)揮切實與Rad3和Rad17的調(diào)控相關。 為進一步探究Rad3和Rad17對RTS1所引起的基因重組類型的影響,本論文采用了一個含有兩個ade6點突變、一個完整his+基因和存在于中間的RTSl序列的腺嘌呤缺陷型(.xde6-L469-his+-RTS1-ade6-M3759)重組菌株進行檢測。波動實驗(fluctuation test)結果顯示,在重組菌株中,Rtfl表達比不表達所產(chǎn)生的ade6+回復突變率高出6.9倍；rad3.d缺失后,重組率進一步增加至12.5倍,而radl7.d突變僅為基礎水平的3.7倍。依照突變子中his+基因的存在與否,發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的重組類型主要為his+基因缺失的重組突變。 綜合上述研究結果,可以得出以下結論：1、對于Rtf1所引起的復制停滯,檢查點激酶Rad3抑制重組蛋白Rad22, Rhp51, RPA募集到RTS1序列,抑制同源重組修復。與之相反,Rad17促進重組蛋白的募集,促進同源重組的進行。2、Exol在同源重組中起到重要作用,Rad3對重組蛋白的抑制作用需要Exo1的存在,可能是通過調(diào)控Exol從而調(diào)節(jié)重組蛋白結合的單鏈DNA長度來起作用。3、通過重組實驗證明,Rad3抑制同源重組,Rad17促進同源重組。
【關鍵詞】：DNA損傷 復制叉阻礙 裂殖酵母 檢查點 同源重組修復
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3411;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 1 前言8-16
• 1.1 裂殖酵母8
• 1.2 細胞周期8-9
• 1.3 細胞周期檢查點9-11
• 1.4 DNA損傷與修復11-13
• 1.5 復制叉與復制叉阻滯系統(tǒng)13-14
• 1.6 檢查點蛋白調(diào)節(jié)重組修復14-15
• 1.7 本文的目的15-16
• 2 材料與方法16-21
• 2.1 材料16-18
• 2.2 方法18-21
• 3 結果21-30
• 3.1 檢查點蛋白對Rad22募集調(diào)控21-23
• 3.2 檢查點蛋白對Rhp51募集調(diào)控23-25
• 3.3 檢查點蛋白對RPA募集調(diào)控25-26
• 3.4 Exol在同源重組修復中的作用26-28
• 3.5 檢查點蛋白對直接重組影響28-29
• 3.6 結論29-30
• 4 討論30-33
• 5 總結33-34
• 參考文獻34-37
• 附錄37-42
• 致謝42

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳漢春;Rad51同系物與DNA重組修復[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2003年04期

2 熊斌;錯配修復基因與腫瘤[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);1997年01期

3 呂嘉春,吳中亮,施侶元,黎銀燕,曾波航,陳家X;核苷酸切除修復基因表達低下與肺癌的關系[J];中國公共衛(wèi)生;2003年07期

  本文關鍵詞：檢查點激酶Rad3和Rad17在重組修復中作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：351215