本文關(guān)鍵詞：Smurf1調(diào)控PIP5K1C蛋白穩(wěn)定性及相關(guān)生物學(xué)功能的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Smurfl屬于HECT類(lèi)的E3泛素連接酶,是NEDD4亞家族的成員,由HECT結(jié)構(gòu)域、WW結(jié)構(gòu)域及C2結(jié)構(gòu)域組成。Smurfl參與調(diào)控多條信號(hào)途徑,如BMP信號(hào)途徑、Wnt信號(hào)途徑以及MAPK信號(hào)途徑等；該蛋白可以靶向調(diào)控多種底物,女Smads、RunX2、 RunX3、Tbx6、MEKK2、RhoA、Par6、Talin及STAT1等,從而參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、成骨細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞極性、細(xì)胞遷移及免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能PIP5K1C是生物體內(nèi)非常重要的磷脂類(lèi)激酶,能夠催化PIP2的生成,并參與調(diào)控多種生物學(xué)功能,如細(xì)胞遷移、黏著斑的形成、胞吞作用等。人源的PIP5K1C有兩個(gè)不同的剪切體：一個(gè)是分子量為87KD的剪切體,被命名為PIP5K1C-87;另一個(gè)是分子量為90KD的剪切體,被命名為PIP5K1C-90。PIP5K1C蛋白的生物學(xué)功能不僅受其相互作用蛋白的調(diào)控,而且還受該蛋白翻譯后修飾的調(diào)控,如磷酸化、乙酰化；然而對(duì)其泛素化修飾,卻鮮有報(bào)道。在本論文的研究中,我們發(fā)現(xiàn)PIP5K1C在肺癌組織中是異常高表達(dá)的,并證明了PIP5K1C受蛋白酶體降解途徑的調(diào)控；而且我們進(jìn)一步通過(guò)knockdown及過(guò)表達(dá)E3泛素連接酶的方法,找到了PIP5K1C的E3泛素連接酶Smurf1,該蛋白能夠調(diào)控PIP5K1C的蛋白穩(wěn)定性；而且通過(guò)體內(nèi)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、體外pull down實(shí)驗(yàn),都能夠檢測(cè)到Smurf1與PIP5K1C的結(jié)合；我們進(jìn)一步明確了Smurf1是通過(guò)增強(qiáng)PIP5K1C的泛素化水平,而調(diào)控PIP5K1C的蛋白穩(wěn)定性的；并且我們找到了Smurf1促進(jìn)PIP5K1C發(fā)生泛素化的關(guān)鍵性位點(diǎn),即K255；而且在生物學(xué)功能上,我們證明了Smurf1能夠抑制PIP5K1C介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及其他相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。進(jìn)一步我們又對(duì)Smurf1降解PIP5K1C的調(diào)控機(jī)制,進(jìn)行了初步的探索。綜上所述,本文提出Smurf1-PIP5K1C途徑在肺癌細(xì)胞中的調(diào)控作用,且Smurf1能夠通過(guò)調(diào)控PIP5K1C的蛋白穩(wěn)定性而影響PIP5K1C介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程,為深入研究這兩個(gè)蛋白的生物學(xué)功能,提供了一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：smurf1 PIP5K1C 泛素化 降解
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 研究背景及文獻(xiàn)綜述12-21
• 第一節(jié) 泛素連接酶Smurf112-17
• 1. 泛素蛋白酶體途徑概述12
• 2. HECT家族E3泛素連接酶12-14
• 3. 泛素連接酶Smurf114-17
• 3.1 Smurf1的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)14
• 3.2 Smurf1的調(diào)控方式14-15
• 3.3 Smurf1的生物學(xué)功能15-17
• 第二節(jié) 磷脂激酶PIP5K1C17-21
• 1. 磷脂酰肌醇-4,-二磷酸(PIP2)17
• 2. I型磷脂酰肌醇4磷酸5激酶(PIP5K1)17-18
• 3. PIP5K1的調(diào)控方式18
• 4. PIP5K1C18-21
• 第二章 材料與方法21-38
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料21-27
• 1. 細(xì)胞株21
• 2. 質(zhì)粒21
• 3. 主要試劑21-23
• 4. 主要抗體23
• 5. shRNA和siRNA序列23-25
• 6. 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備25-26
• 7. 實(shí)驗(yàn)耗材26-27
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法27-38
• 1. 實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒的構(gòu)建27-29
• 2. 293T細(xì)胞株的體外培養(yǎng)、傳代及鋪板29-30
• 3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染30
• 4. 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)30-31
• 5. 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)31-32
• 6. Pull Down實(shí)驗(yàn)32
• 7. 免疫熒光技術(shù)32-33
• 8. 體內(nèi)泛素化法(變性)實(shí)驗(yàn)33-34
• 9. 體外泛素化實(shí)驗(yàn)34
• 10. RT-PCR34-36
• 11. MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)36
• 12. Pulse chase實(shí)驗(yàn)36-37
• 13. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)Ca~(2+)含量37
• 14. 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferase assay)37-38
• 第三章 結(jié)果與分析38-64
• 第一節(jié) PIP5K1C在肺癌組織中高表達(dá)且能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖38-39
• 第二節(jié) Smurf1調(diào)控PIP5K1C的蛋白穩(wěn)定性39-45
• 1. PIP5K1C蛋白水平受泛素蛋白酶體途徑調(diào)控39-40
• 2. PIP5K1C的E3泛素連接酶的確定40-41
• 3. 外源Smurf1調(diào)控PIP5K1C的蛋白穩(wěn)定性41-43
• 4. 內(nèi)源Smurf1調(diào)控內(nèi)源性PIP5K1C的蛋白穩(wěn)定性43
• 5. Smurf1能夠影響PIP5K1C的半衰期43-45
• 第三節(jié) Smurf1與PIP5K1C的相互作用45-50
• 1. 外源性Smurf1與PIP5K1C相互作用45
• 2. 內(nèi)源性Smurf1與PIP5K1C的相互作用45-46
• 3. Smurf1與PIP5K1C存在直接的相互作用46-47
• 4. Smurf1與PIP5K1C可以共定位47
• 5. Smurf1與PIP5K1C相互作用結(jié)構(gòu)域的確定47-49
• 6. Smurf1的C2結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡{(diào)控PIP5K1C的蛋白穩(wěn)定性的必要性49-50
• 第四節(jié) Smurf1促使PIP5K1C發(fā)生泛素化50-53
• 1. 在體內(nèi)Smurf1能夠促進(jìn)PIPSK1C的泛素化50
• 2. 內(nèi)源Smurf1能夠促進(jìn)PIP5K1C的泛素化50-51
• 3. 在體外Smurf1能夠促進(jìn)PIP5K1C的泛素化51-53
• 第五節(jié) Smurf1泛素化PIP5K1C位點(diǎn)的確定53-57
• 1. 泛素化位點(diǎn)的確定53-54
• 2. PIP5K1C上的K255是其被Smurf1泛素化的關(guān)鍵性位點(diǎn)54-55
• 3. PIP5K1C的K255位突變后,并不影響其與其他蛋白的結(jié)合55-57
• 第六節(jié) Smurf1抑制P15K1C介導(dǎo)的細(xì)胞增殖57-58
• 第七節(jié) Smurf1影響PIP5K1C介導(dǎo)的其他生物學(xué)過(guò)程58-60
• 1. Smurf1抑制PIP5K1C介導(dǎo)的胞內(nèi)Ca~(2+)含量的增加58
• 2. Smurf1能夠抑制PIP5K1C介導(dǎo)的β-catenin活性的增強(qiáng)58-60
• 第八節(jié) Smurf1對(duì)PIP5K1C的降解的調(diào)控機(jī)制的初步探索60-64
• 1. Smurf1對(duì)PIP5K1C的降解受PKA磷酸化的調(diào)控60-61
• 2. Smurf1降解PIP5K1C受Cdh1的調(diào)控61-62
• 3. 關(guān)于Smurf1降解PIP5K1C調(diào)控機(jī)制的其他探索62-64
• 第四章 總結(jié)與討論64-67
• 附錄Ⅰ67-72
• 附錄Ⅱ 科研成果72-73
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 致謝78

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