本文關(guān)鍵詞：外源p204對斑馬魚先天免疫的影響和p204轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：天然免疫和適應(yīng)性免疫共同組成一了動物的免疫系統(tǒng)。天然免疫是機(jī)體防御病原微生物感染的第一道防線,在天然免疫系統(tǒng)中最重要的一環(huán)就是模式識別受體PRRs對病原微生物模式相關(guān)分子PAMPs的識別。TLR是重要的胞外和胞內(nèi)受體,參與到NF-κB和IRF激活的信號通路,引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)。天然免疫和適應(yīng)性免疫不是獨(dú)立的兩個(gè)系統(tǒng),相反,天然免疫的重要分子和信號通路可以激活適應(yīng)性免疫。在這個(gè)機(jī)制中,TLRs信號通路是聯(lián)系天然免疫與適應(yīng)性免疫的紐帶。 斑馬魚與人類一樣具有天然免疫和適應(yīng)性免疫。對斑馬魚適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的研究已有多年,取得了重要的研究成果,研究技術(shù)也有很大的提高。然而,對斑馬魚天然免疫系統(tǒng)的研究才剛剛起步。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原微生物感染的第一道防線,而且對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活有重要的影響。因此在斑馬魚中深入研究天然免疫系統(tǒng)不僅可以促進(jìn)我們對斑馬魚自身的免疫系統(tǒng)的認(rèn)識,而且從進(jìn)化的角度看,也為研究高等脊椎動物免疫系統(tǒng)提供思路和工具。并且斑馬魚因其個(gè)體小、易于飼養(yǎng)、性成熟周期短、易繁殖和繁殖率高、胚胎透明易觀察、便于胚胎操作等優(yōu)勢,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因功能的相關(guān)研究。 本研究以斑馬魚為動物模型,采用顯微注射的方式將外源的p204質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚受精卵中,通過觀察報(bào)告基因GFP的熒光表達(dá),發(fā)現(xiàn)p204在斑馬魚胚胎中從8hp研始表達(dá),表達(dá)位置主要集中載斑馬魚的胸腹部,在8hpf-8dpf時(shí)期p204大量表達(dá),8dpf后p204的表達(dá)量會逐漸減少,直至11dpf右發(fā)現(xiàn)熒光完全消失。p204-EGFP質(zhì)粒注射后導(dǎo)致斑馬魚表型變化,產(chǎn)生畸形,出現(xiàn)腹部變大、尾部彎曲等狀況。 對注射后的斑馬魚胚胎,選取其中表達(dá)綠色熒光的胚胎進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測,檢測先天免疫相關(guān)的基因tbk1和sting,通過實(shí)時(shí)定量檢測,發(fā)現(xiàn)p204注射后能夠引起相應(yīng)的先天免疫相關(guān)基因tbkl和sting表達(dá)量在8hpf-48hpf階段比對照組都有明顯上調(diào),而之前4hp階段段的表達(dá)量并沒有明顯變化。另外進(jìn)行了相應(yīng)基因的原位雜交檢測,其結(jié)果與實(shí)時(shí)定量結(jié)果相吻合。為了能夠獲得p204整合進(jìn)入斑馬魚基因組中的突變體,我們利用tol2轉(zhuǎn)座子攜帶p204,構(gòu)建tol2-p204的載體,并將其和TP轉(zhuǎn)座酶一起共注射到斑馬魚受精卵中。研究結(jié)果表明：1外源p204基因可以在一定程度上影響斑馬魚的發(fā)育,造成斑馬魚的畸形；2.p204能夠影響斑馬魚先天免疫,參與相關(guān)信號通路；3.tol2-p204載體構(gòu)建成功,并且導(dǎo)入斑馬魚受精卵中,但p204在斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)不夠穩(wěn)定。本研究為進(jìn)一步以斑馬魚為模式動物研究先天免疫相關(guān)分子機(jī)制和掰馬魚與哺乳動物先天免疫信號途徑的進(jìn)化關(guān)系提供了新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 先天免疫 p204 tbk1 sting TLR
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392;Q782
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符號說明10-11
• 1. 前言11-19
• 1.1 p204的生物學(xué)作用11-12
• 1.2 脊椎動物先天免疫簡介12-14
• 1.3 斑馬魚作為模式動物的優(yōu)勢14
• 1.4 斑馬魚先天免疫相關(guān)信號通路14-16
• 1.5 斑馬魚研究常用技術(shù)16-17
• 1.5.1 斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)16
• 1.5.2 突變體技術(shù)16-17
• 1.5.3 胚胎原位雜交技術(shù)17
• 1.5.4 基因過表達(dá)技術(shù)17
• 1.6 Tol2轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用17
• 1.7 研究思路和意義17-19
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料與方法19-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料試劑與儀器19-24
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑19-23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動物23
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.2 方法24-48
• 2.2.1 斑馬魚的飼養(yǎng)與繁殖24-25
• 2.2.2 p204-EGFP質(zhì)粒的擴(kuò)增與線性化25-29
• 2.2.3 顯微注射29-30
• 2.2.4 胚胎發(fā)育熒光觀察和統(tǒng)計(jì)30
• 2.2.5 免疫相關(guān)基因的表達(dá)檢測30-42
• 2.2.6 斑馬魚p204轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建42-48
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-58
• 3.1 p204-EGFP和EGFP-N1質(zhì)粒擴(kuò)增、線性化和純化結(jié)果48
• 3.2 熒光觀察和熒光率、胚胎致死率的統(tǒng)計(jì)48-50
• 3.3 先天免疫相關(guān)基因?qū)崟r(shí)定量檢測結(jié)果50-53
• 3.3.1 各時(shí)期斑馬魚總RNA提取檢測結(jié)果50-51
• 3.3.2 反轉(zhuǎn)cDNA擴(kuò)增目的條帶結(jié)果51
• 3.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果51-53
• 3.4 sting和tbk1基因原位雜交結(jié)果53-54
• 3.4.1 sting和tbk1探針的合成結(jié)果53
• 3.4.2 sting和tbk1原位雜交結(jié)果53-54
• 3.5 p204轉(zhuǎn)基因載體tol2-p204的構(gòu)建結(jié)果54-58
• 3.5.1 p204基因的擴(kuò)增54-55
• 3.5.2 tol2-p204質(zhì)粒線性化結(jié)果55-56
• 3.5.3 pCS-TP質(zhì)粒線性化與體外合成mRNA56-57
• 3.5.4 tol2-p204與TP轉(zhuǎn)座酶共注射后斑馬魚熒光觀察57-58
• 4. 討論58-63
• 4.1 斑馬魚作為模式生物研究TLR信號通路58-59
• 4.2 p204注射到斑馬魚胚胎中的表達(dá)與穩(wěn)定性59-60
• 4.3 p204標(biāo)記物對p204的影響60-61
• 4.4 斑馬魚實(shí)時(shí)定量和和原位雜交注意事項(xiàng)61-62
• 4.5 斑馬魚用于研究先天免疫信號通路的展望62-63
• 5. 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文73-74
• 附件74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 何新,劉桂生,陳清軒,魏慶信,陳永福;轉(zhuǎn)基因豬外源基因染色體定位的研究[J];動物學(xué)報(bào);1998年02期

2 孟立;張艷麗;范欽龍;黃榮;王子玉;王鋒;;轉(zhuǎn)座子Tol2的特性及其在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2009年11期

3 鄒鈞;謝岳峰;劉東;朱作言;;外源基因在鯽魚胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)[J];水生生物學(xué)報(bào);1991年04期

4 吳波,朱作言;轉(zhuǎn)基因動物整合位點(diǎn)的研究進(jìn)展[J];遺傳;2003年01期

  本文關(guān)鍵詞：外源p204對斑馬魚先天免疫的影響和p204轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：349631