本文關(guān)鍵詞：志賀菌中CRISPR的分布及其結(jié)構(gòu)特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：志賀菌屬細(xì)菌是急性感染性腹瀉的主要病原體之一，由志賀菌引起的細(xì)菌性痢疾的發(fā)病率居我國感染性腹瀉病首位。隨著抗生素的廣泛使用，志賀菌的耐藥現(xiàn)象越來越普遍，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌耐藥性增強的主要方式之一。 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat, CRISPR）是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)菌橫向基因轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的一個遺傳結(jié)構(gòu)，能夠有效地防御基因的水平轉(zhuǎn)移。因此了解細(xì)菌中CRISPR的存在與否及其特征，對于探討細(xì)菌耐藥狀況及其機制，尤其了解細(xì)菌橫向基因轉(zhuǎn)移情況具有重要意義。而CRISPR在志賀菌中的分布情況未見報道。 本課題檢測實驗室保存的志賀菌CRISPR系統(tǒng)相關(guān)基因并測序，分析志賀菌中CRISPR的分布情況及其特征，為進一步揭示志賀菌橫向基因轉(zhuǎn)移規(guī)律及其與細(xì)菌耐藥等特性的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。 研究方法 對196株志賀菌進行生化鑒定，，其中江西分離株9株，河南分離株176株，北京分離株5株，中國藥品檢定所6株；K-B紙片法進行藥敏試驗；PCR擴增志賀菌CRISPR相關(guān)序列；DNA測序，并對核苷酸序列進行分析；采用隨機引物法標(biāo)記制作探針，斑點雜交。 結(jié)果 1.在196株志賀菌株中均檢測出cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因。以志賀菌分離時間的中位數(shù)2004年為分界點分為兩組，其中CRISPR-S1、CRISPR-S4在兩組之間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而CRISPR-S2、CRISPR-S3在兩組的分布沒有差異。 2.在90株志賀菌中共檢出260條間隔序列，與CRISPR DB數(shù)據(jù)庫比對，207條是已有的志賀菌間隔序列，另外53條是新發(fā)現(xiàn)的志賀菌間隔序列。 3.志賀菌CRISPR同一個位點的重復(fù)序列相對保守，有的重復(fù)序列在5'端或3'端會出現(xiàn)堿基缺失和變異。 4. BLAST發(fā)現(xiàn)與cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因高度同源的細(xì)菌包括志賀菌和大腸桿菌。志賀菌CRISPR系統(tǒng)的重復(fù)序列和間隔序列在CRISPR DB數(shù)據(jù)庫BLAST，與大腸桿菌、沙門氏菌中甚至一些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株同源性較高。 5.選取3株志賀菌進行cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因測序，測序結(jié)果與GenBank上公布的含有CRISPR的Shigella sonnei53G進行比對，發(fā)現(xiàn)cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因均有不同程度的差異，進一步做藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)cas2基因的差異和細(xì)菌耐藥程度存在關(guān)聯(lián)。 6.設(shè)計出志賀菌cas基因和重復(fù)序列探針，地高辛標(biāo)記后與志賀菌基因組DNA進行斑點雜交，產(chǎn)生雜交信號。 結(jié)論 1. CRISPR系統(tǒng)在志賀菌中廣泛存在；不同時間分離的志賀菌的CRISPR位點S1和S4分布有差異。 2. Cas2基因差異與志賀菌耐藥程度有關(guān)。 3.志賀菌CRISPR系統(tǒng)與大腸桿菌的同源性較高。 4.設(shè)計出志賀菌CRISPR系統(tǒng)相關(guān)的PCR引物；實現(xiàn)了志賀菌CRISPR系統(tǒng)的探針制備及雜交方法的建立。
【關(guān)鍵詞】：志賀菌 耐藥 CRISPR 系統(tǒng) 斑點雜交
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378;R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目錄8-11
• 圖表索引11-12
• 英文縮略詞12-13
• 1 引言13-15
• 2 材料與方法15-26
• 2.1 實驗材料15-20
• 2.1.1 菌株來源15
• 2.1.2 主要試劑15-17
• 2.1.3 主要試劑配方17-18
• 2.1.4 生物信息學(xué)軟件18
• 2.1.5 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器18
• 2.1.6 主要設(shè)備及儀器18-20
• 2.2 實驗方法20-26
• 2.2.1 腹瀉標(biāo)本采集、運送、包裝、保存20
• 2.2.2 志賀菌的分離和鑒定20-21
• 2.2.3 改良 Kirby-Bauer（K-B）法進行藥敏試驗21-22
• 2.2.4 核酸序列分析22
• 2.2.5 引物設(shè)計22-23
• 2.2.6 PCR 擴增和凝膠電泳23
• 2.2.7 寡核苷酸探針設(shè)計23
• 2.2.8 地高辛標(biāo)記志賀菌 cas2 基因的 DNA 探針及標(biāo)記效率的檢測23-24
• 2.2.9 斑點雜交24-26
• 3 結(jié)果26-53
• 3.1 志賀菌中 CRISPR 系統(tǒng)的分布26-30
• 3.1.1 志賀菌 cas1、cas2 基因的分布26
• 3.1.2 志賀菌 CRISPR 位點的檢測26-30
• 3.1.3 志賀菌 CRISPR 位點的分布30
• 3.2 CRISPR DB 數(shù)據(jù)庫中志賀菌的 CRISPR 信息30-34
• 3.3 實驗室保存的志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特征34-43
• 3.3.1 志賀菌 cas1、cas2 基因核苷酸測序結(jié)果分析34
• 3.3.2 志賀菌 CRISPR 位點測序結(jié)果分析34-37
• 3.3.3 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特征37-38
• 3.3.4 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)間隔序列的結(jié)構(gòu)特點38-43
• 3.4 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)的同源序列43-46
• 3.4.1 志賀菌的 cas1 基因和 cas2 基因的同源序列43-44
• 3.4.2 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)的重復(fù)序列的同源序列44
• 3.4.3 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)的間隔序列的同源序列44-46
• 3.5 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)和耐藥關(guān)系的初步探索46-50
• 3.5.1 志賀菌 cas 基因的差異46-49
• 3.5.2 志賀菌藥敏結(jié)果49-50
• 3.6 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)相關(guān)基因的斑點雜交50-53
• 3.6.1 志賀菌 cas2 基因的斑點雜交50-51
• 3.6.2 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)重復(fù)序列的斑點雜交51-53
• 4 討論53-59
• 4.1 志賀菌中 CRISPR 系統(tǒng)的分布53-54
• 4.1.1 志賀菌中 CRISPR 相關(guān)基因 cas1 和 cas2 的分布53
• 4.1.2 志賀菌中 CRISPR 位點的分布53-54
• 4.2 志賀菌中 CRISPR 系統(tǒng)重復(fù)序列的特點54-55
• 4.3 志賀菌中 CRISPR 系統(tǒng)間隔序列的特點55-56
• 4.4 志賀菌中 CRISPR 系統(tǒng)的同源序列56-57
• 4.5 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)與耐藥關(guān)系的探討57-58
• 4.6 志賀菌 CRISPR 系統(tǒng)相關(guān)基因的斑點雜交58-59
• 5 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-63
• 綜述63-77
• 參考文獻72-77
• 個人簡歷、攻讀碩士期間發(fā)表論文及研究成果77-78
• 致謝78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 方銳;暢飛;孫照霖;李寧;孟慶勇;;CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點編輯技術(shù)[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2013年08期

2 李鐵民;杜波;;CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體的共進化[J];遺傳;2011年03期

3 宋春花;黃學(xué)勇;郗園林;張梅喜;段廣才;;志賀菌敏感株與基因轉(zhuǎn)移耐多藥株蛋白組學(xué)分析[J];中國公共衛(wèi)生;2008年01期

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  本文關(guān)鍵詞：志賀菌中CRISPR的分布及其結(jié)構(gòu)特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：346937