本文關(guān)鍵詞：含hTK1和hTIMP1雙基因載體的構(gòu)建及在大鼠血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 據(jù)研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP1）對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)形成具有重要作用；本課題前期研究發(fā)現(xiàn)含人組織激肽釋放酶1（hTK1）基因過(guò)表達(dá)具有部分抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和改善血管再狹窄的作用，但兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及血管重塑是否具有協(xié)同效應(yīng)或疊加效應(yīng)，目前尚未明了。本課題首先構(gòu)建含基因hTK1和hTIMP1雙基因共表達(dá)的重組腺病毒載體，并觀察目的基因在大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）中表達(dá)情況。 方法 第一部分 1.購(gòu)買含hTIMP1基因的原始質(zhì)粒，經(jīng)鑒定其正確性后，采用酶切、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收、連接酶切產(chǎn)物，經(jīng)熱休克等克隆構(gòu)建含強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）和hTIMP1的重組穿梭質(zhì)粒，并鑒定其正確性。 2.選擇相應(yīng)內(nèi)切酶位點(diǎn)，，對(duì)含hTIMP1基因的重組質(zhì)粒和pDC316-hTK1質(zhì)粒（本研究室保存）進(jìn)行酶切并擴(kuò)增目的基因片段，將兩者PCR產(chǎn)物回收、連接、熱休克法轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌和挑取克隆，構(gòu)建含hTK1和hTIMP1雙基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切分析和測(cè)序方法鑒定其正確性。 3.將重組質(zhì)粒線性化，并同骨架病毒質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre于293A細(xì)胞中包裝，經(jīng)包裝獲得重組腺病毒，用TICD50法測(cè)定病毒滴度。 第二部分 1.采用組織貼塊法原代培養(yǎng)來(lái)自Sprague-Dawley (SD)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，經(jīng)鑒定后，選取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用三種重組腺病毒（Ad5-EGFP、 Ad5-hTIMP1-EGFP與Ad5-hTK1-hTIMP1）感染細(xì)胞，分別以不同感染復(fù)數(shù)（MOI）和不同感染時(shí)間，觀察目的基因的表達(dá)情況。 2. Real-Time PCR法測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。 3. Western Blot法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。 4.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1.經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序分析結(jié)果，重組質(zhì)粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pDC316-hTK1-hTIMP1構(gòu)建正確，在293A細(xì)胞中成功包裝重組腺病毒Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1,其滴度分別為7.0×1011vp/ml和8.5×1011vp/ml。 2. Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后，Real-TimePCR法檢測(cè)目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的mRNA水平呈現(xiàn)高表達(dá)，并呈現(xiàn)感染復(fù)數(shù)（50-150MOI）和時(shí)間（1-3d）依賴性增加。 3. Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后，Wester-blot法檢測(cè)目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，并呈現(xiàn)感染復(fù)數(shù)（50-100MOI）依賴性增加。 4. Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后，細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈現(xiàn)表達(dá)。紅色標(biāo)記為目的基因蛋白在細(xì)胞中的表達(dá),藍(lán)色標(biāo)記為細(xì)胞核染色。 結(jié)論 1.采用雙啟動(dòng)子CMV策略，首次成功構(gòu)建并包裝了含hTK1和hTIMP1雙基因共表達(dá)的重組腺病毒載體Ad5-hTK1-hTIMP1，病毒滴度為7.0×10~(11)vp/ml。 2.雙基因重組腺病毒載體感染大鼠VSMCs后，檢測(cè)到目的基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平呈現(xiàn)獨(dú)立高表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：人組織激肽釋放酶-1 人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1 血管平滑肌細(xì)胞 重組腺病毒載體 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 構(gòu)建含 hTK1 和 hTIMP1 雙基因共表達(dá)的重組腺病毒載體13-42
• 材料與方法13-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-40
• 討論40-42
• 第二部分 雙基因共表達(dá)載體在大鼠血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)42-66
• 材料與方法42-51
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-63
• 討論63-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72-73
• 綜述73-78
• 參考文獻(xiàn)77-78

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：346432