本研究旨在突變3T3-L1細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GluT4）的基因序列,造成GluT4功能障礙,從而獲得一種穩(wěn)定、自發(fā)胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)3T3-L1細(xì)胞的GluT4編碼區(qū)進(jìn)行定向切割,通過流式細(xì)胞術(shù)和基因測序篩選穩(wěn)定突變的細(xì)胞株;使用CCK-8法檢測所篩選細(xì)胞株的增殖活力;對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化,油紅O染色以判斷細(xì)胞成脂分化能力;以胰島素刺激下葡萄糖攝入量確定細(xì)胞對(duì)胰島素的抵抗程度;qPCR和Western blot檢測胰島素抵抗細(xì)胞成脂分化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)。結(jié)果表明:第九外顯子處13 bp的缺失導(dǎo)致3T3-L1細(xì)胞GluT4蛋白功能障礙,這一突變不影響細(xì)胞的增殖活力;成脂誘導(dǎo)分化過程中,該細(xì)胞株表現(xiàn)出嚴(yán)重且穩(wěn)定的自發(fā)胰島素抵抗,葡萄糖攝取受阻,與成脂分化和脂質(zhì)合成相關(guān)的基因表達(dá)顯著或極顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01）。綜上所述,GluT4功能障礙阻礙了脂肪細(xì)胞響應(yīng)胰島素的葡萄糖攝取,從而造成脂肪細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)的胰島素抵抗;本研究從多個(gè)角度對(duì)該胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型進(jìn)行檢測分析,驗(yàn)證了其穩(wěn)定性和有效性,為脂肪營養(yǎng)代謝和胰島素抵... 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019,50(07)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒載體及菌種
        1.1.2 試劑與儀器
    1.2 方法
        1.2.1 gRNA設(shè)計(jì)及切割效率驗(yàn)證
        1.2.2 穩(wěn)定突變細(xì)胞株的篩選
        1.2.3 Western blot及細(xì)胞增殖活力檢測
        1.2.4 成脂誘導(dǎo)分化
        1.2.5 葡萄糖攝取及三酰甘油釋放量檢測
        1.2.6 GluT4及糖脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄檢測
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié) 果
    2.1 gRNA的選擇
    2.2 穩(wěn)定突變GluT4的細(xì)胞株篩選
    2.3 細(xì)胞的蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖活力
    2.4 成脂誘導(dǎo)分化
    2.5 葡萄糖消耗及三酰甘油釋放量
    2.6 GluT4及糖脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄檢測
3 討 論
4 結(jié) 論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型研究現(xiàn)狀[J]. 雷婷,涂珺.  江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(03)
[2]葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制[J]. 張楠,趙穎.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2016(03)
[3]胰島素誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立[J]. 劉曉華,江湖,李海星,李超波,曹郁生.  食品科學(xué). 2012(19)
[4]Berberine reverses free-fatty-acid-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes through targeting IKKβ[J]. Ping Yi, Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China Fu-Er Lu, Li-Jun Xu, Guang Chen, Kai-Fu Wang, Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2008(06)



本文編號(hào)：3464218