本文關(guān)鍵詞：NOD8對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO、TNF-α和IL-1β的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 探討NOD8對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis facto-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的影響。 方法： pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒經(jīng)陽離子聚合物JetPeiR I M E介導(dǎo)轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞，篩選最適pEGFP-NOD8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度；pEGFP-C2空質(zhì)粒及pEGFP-NOD8質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并檢測NOD8蛋白表達(dá)情況；在此基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)設(shè)為四組：（1）陰性對照組（negetive control）：新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，不做任何處理；（2）pEGFP-C2組：RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C2空質(zhì)粒24h后，更換為不含LPS的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（3）pEGFP-C2+LPS組：pEGFP-C2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后，更換為含1mg/L脂多糖的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（4）pEGFP-NOD8+LPS組：pEGFP-NOD8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后，更換為含1mg/L LPS的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；隨后分別培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞0、6、12、24h，采用Griess reagent法測定不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞分泌的NO水平；以及ELISA法檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組IL-1β和TNF-α的含量；熒光法測定不同時(shí)間點(diǎn)各組caspase-1的活化水平，并采用Western blotting檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞胞漿NF-κB p65亞基蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果: （1）通過MTT檢測pEGFP-NOD8質(zhì)粒不同轉(zhuǎn)染劑量對RAW264.7細(xì)胞活力的影響以及pEGFP-NOD8不同轉(zhuǎn)染劑量對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的釋放量的影響確定了3μg/mL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度作為最佳轉(zhuǎn)染劑量；pEGFP-C2空質(zhì)粒和pEGFP-NOD8質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，，倒置熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功；并進(jìn)一步通過Western blotting檢測NOD8蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pEGFP-C2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比較，pEGFP-NOD8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組其NOD8蛋白表達(dá)明顯增加；（2）與陰性對照組和pEGFP-C2組比較，LPS分別刺激RAW264.7細(xì)胞6、12、24h，pEGFP-C2+LPS組隨著時(shí)間的延長釋放NO和IL-1β均明顯增加，且呈時(shí)間依賴效應(yīng)；與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組在6h NO的釋放量無明顯變化（P0.05）；但在12h和24h NO的釋放顯著降低（均P㩳0.01）；而IL-1β于6、12、24h的釋放均明顯降低（P㩳0.01, P㩳0.05, P㩳0.01）；此外，pEGFP-C2+LPS組細(xì)胞上清TNF-α的含量在6h、12h和24h均顯著增加；但pEGFP-NOD8+LPS組與pEGFP-C2+LPS組相比，TNF-α的濃度在各時(shí)點(diǎn)均無明顯變化（P㧐0.05）；（3）LPS刺激RAW264.7細(xì)胞6、12、24h，pEGFP-C2+LPS組caspase-1活化水平均明顯升高，而與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組caspase-1活化水平在各時(shí)點(diǎn)均顯著下降；（4）pEGFP-C2+LPS組細(xì)胞胞漿中的p65的蛋白表達(dá)在LPS刺激RAW264.7細(xì)胞6、12和24h后逐漸減少；與pEGFP-C2+LPS組相比，pEGFP-NOD8+LPS組胞漿內(nèi)的p65表達(dá)在各時(shí)點(diǎn)均明顯增加。 結(jié)論: （1）pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入RAW264.7巨噬細(xì)胞，NOD8蛋白表達(dá)較pEGFP-C2空質(zhì)粒組明顯增加。 （2）在LPS刺激RAW264.7細(xì)胞的0、6、12、24h，過表達(dá)NOD8在12和24h可抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放；并分別于6、12和24h抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β分泌；但對TNF-α的釋放量在各時(shí)間點(diǎn)則均無明顯作用。 （3）過表達(dá)NOD8在6、12、24h均可抑制LPS誘導(dǎo)的caspase-1活化以及NF-κB p65亞基的核位移。綜上所述，NOD8可抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO和IL-1β，其作用機(jī)制可能與NOD8抑制caspase-1及NF-κB的活化有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：RAW264.7 脂多糖 NOD8 NF-κB 一氧化氮 白細(xì)胞介素-1β
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 前言8-18
• 一、 NLRs家族結(jié)構(gòu)9-11
• 二、 NLRs在識(shí)別微生物方面的作用11-12
• 三、 NLRs家族的信號(hào)傳導(dǎo)12-14
• 四、 NLRs與相關(guān)疾病14
• 五、 NOD8的結(jié)構(gòu)和研究進(jìn)展14-18
• 第一部分 NOD8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的效率及 NOD8 蛋白表達(dá)18-41
• 材料和方法18-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-41
• 第二部分 NOD8 對 LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放 NO、IL-1Β和 TNF-Α的影響41-49
• 材料和方法41-46
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 第三部分 NOD8 對 LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 CASPASE-1 活化及 P65 蛋白核位移的影響49-55
• 材料和方法49-53
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-55
• 討論55-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-69
• 縮略詞表69-72
• 在讀期間發(fā)表文章72-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 胡巢鳳;參與免疫及炎癥反應(yīng)調(diào)控的胞漿蛋白NODs[J];中國病理生理雜志;2004年07期

2 王嬌莉;徐峰;沈華浩;;NOD蛋白與肺部疾病[J];中國病理生理雜志;2008年10期

  本文關(guān)鍵詞：NOD8對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO、TNF-α和IL-1β的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：345325