本文關(guān)鍵詞：蛋白酶Corin在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：Corin是心臟中發(fā)現(xiàn)的一種II型跨膜絲氨酸蛋白酶，在調(diào)節(jié)血壓和維持心臟功能方面起重要作用。除心臟外，corin也表達(dá)于其它組織，如腎臟、骨骼組織、妊娠子宮等。最近有研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）中也有corin表達(dá)，為進(jìn)一步探討corin在MSCs中的作用，本研究通過檢測MSCs分化過程中corin mRNA及蛋白的表達(dá)，探討corin與BM-MSCs分化的關(guān)系，為進(jìn)一步研究蛋白酶corin的功能及其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用提供依據(jù)。 方法： （1）收集正常骨折病人骨髓，采用密度梯度離心法收集含有MSCs的低密度層，獲取原代MSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 （2）取第三代MSCs，在特定誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞，并通過特異性染色和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription PCR，RT-PCR）法進(jìn)行鑒定。 （3）利用RT-PCR技術(shù)對(duì)MSCs定向分化過程中corin mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析。 （4）利用實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測MSCs分化過程中corin mRNA的表達(dá)水平，并進(jìn)行定量分析。 （5）免疫熒光染色檢測MSCs成軟骨分化中corin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： （1）我們收集了8例正常骨折病人骨髓，均培養(yǎng)出原代MSCs細(xì)胞，細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)排列呈螺旋狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞基本保持長梭形的形態(tài)。流式細(xì)胞學(xué)檢測到細(xì)胞表達(dá)CD44、CD73、CD90而不表達(dá)CD34。 （2）通過茜素紅染色、油紅O染色、阿爾新藍(lán)染色分別檢測BM-MSCs成骨、成脂、成軟骨分化的可行性，我們觀察到被茜素紅染成紅色的鈣結(jié)節(jié)，被油紅O染成深紅色的脂肪小滴，被阿而新藍(lán)染成藍(lán)色的硫酸多聚糖。 （3）通過RT-PCR及qRT-PCR檢測到BM-MSCs向成骨、脂肪、成軟骨細(xì)胞分化過程中均有corin表達(dá)，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，corin的相對(duì)表達(dá)量逐漸增多（p0.05vs.0d）。 （4）通過qRT-PCR觀察到BM-MSCs在成軟骨分化4w時(shí)corin mRNA表達(dá)量最高，我們選取4w時(shí)成軟骨分化細(xì)胞微球，通過免疫熒光染色檢測到分化后的BM-MSCs中corin蛋白表達(dá)陽性。 結(jié)論： （1）原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛，傳代以后純化度可達(dá)90%以上，傳至10代以上仍能保持固定的長梭形細(xì)胞形態(tài)。 （2）BM-MSCs具有很強(qiáng)的多向分化特性，，可作為細(xì)胞工程中理想的種子細(xì)胞。 （3）在BM-MSCs分化過程中，通過RT-PCR和免疫熒光法均檢測到corin的表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，corin表達(dá)量逐漸增高，說明corin有可能參與了BM-MSC分化過程。 目的：骨性關(guān)節(jié)炎是中老年人最常見的慢性軟骨損傷性疾病之一，其發(fā)病機(jī)理主要是以軟骨慢性磨損為特點(diǎn)。我們前期的研究顯示，在BM-MSCs向成軟骨細(xì)胞分化時(shí)，corin表達(dá)量顯著增高，為研究corin在BM-MSCs向成軟骨分化中的作用，我們采用RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)將BM-MSCs中corin mRNA特異性沉默，并觀察沉默后的BM-MSCs細(xì)胞成軟骨能力的改變。 方法： （1）采用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒，并轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293-corin細(xì)胞，用于抑制corinmRNA的表達(dá)，通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測干擾效率，并篩選出最優(yōu)病毒株，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的BM-MSCs。 （2）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)用于檢測corin被抑制后的BM-MSCs遷移能力。 （3）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測corin被抑制后的BM-MSCs增殖能力。 （4）免疫組織化學(xué)方法檢測corin基因被抑制后BM-MSCs成軟骨分化能力的變化，并用Image Pro-Plus軟件分析IHC圖片中陽性染色區(qū)域的平均光密度，評(píng)價(jià)正常BM-MSCs及干擾后BM-MSCs誘導(dǎo)后特異性指標(biāo)的表達(dá)水平。 結(jié)果： （1）利用HEK293-corin細(xì)胞篩選最佳病毒株，通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測病毒侵染后的HEK293-corin細(xì)胞中corin mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)第V2LHS_12562株病毒沉默效果最好，將這株病毒侵染BM-MSCs發(fā)現(xiàn)corin mRNA抑制了80%以上，而對(duì)照組corin mRNA僅沉默了5%左右（p0.01vs. siCTRL）。 （2）抑制BM-MSCs中corin mRNA表達(dá)對(duì)BM-MSCs細(xì)胞的遷移及增殖能力均未有顯著影響。 （3）抑制BM-MSCs中corin mRNA表達(dá)影響了BM-MSCs向成軟骨分化，檢測軟骨特異性的硫酸化多糖和II型膠原蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其形成量明顯減少，IPP軟件分析siCORIN組和siCTRL組中圖片藍(lán)色及棕色區(qū)域面積，發(fā)現(xiàn)其面積均明顯減少（硫酸化多糖面積：18.9%vs.60.6%, p0.01; II型膠原蛋白面積：11.4%vs.39.5%, p0.05）。同時(shí)通過qRT-PCR法檢測軟骨特異性基因COL2A1和COMP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量也明顯降低（*p0.05；**p0.01vs. siCTRL）。 結(jié)論： 我們通過RNA干擾技術(shù)成功的將BM-MSCs中corin基因沉默，并且corin基因沉默后的BM-MSCs細(xì)胞增殖及遷移能力未受明顯影響，我們將corin表達(dá)下調(diào)的BM-MSCs向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)，檢測軟骨特異性蛋白及基因，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量均降低，這說明corin基因被抑制后，BM-MSCs成軟骨分化能力減弱，由此，我們推斷出corin參與了BM-MSCs的成軟骨分化過程，這為臨床疾病如骨關(guān)節(jié)炎等的治療提供了一個(gè)很好的入口。
【關(guān)鍵詞】：Corin 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 成軟骨細(xì)胞 染色 Corin 慢病毒 基因沉默 成軟骨分化
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-16
• 參考文獻(xiàn)13-16
• 第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化過程中 corin 的表達(dá)16-32
• 前言16-17
• 材料和方法17-23
• 結(jié)果23-29
• 討論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-32
• 第二部分 Corin 在 BM-MSCs 成軟骨分化過程中的作用研究32-47
• 前言32-33
• 材料與方法33-39
• 結(jié)果39-43
• 討論43-45
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 結(jié)論47-48
• 綜述48-57
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 附件57-59
• 碩士研究生期間發(fā)表的論文59-60
• 致謝60-62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李寧華;;中老年人群骨關(guān)節(jié)炎的流行病學(xué)特征[J];中國臨床康復(fù);2005年38期

  本文關(guān)鍵詞：蛋白酶Corin在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：344904