第一部分 HGV作為復(fù)制型基因治療載體的實(shí)驗(yàn)研究 庚型肝炎病毒（hepatitis G virus，HGV）是單正鏈的RNA病毒，長約9.4Kb，含一個(gè)開放讀碼框架，編碼2900左右的氨基酸。病毒具有細(xì)胞親嗜性，分別存在著淋巴細(xì)胞和肝細(xì)胞親嗜株，本室建立的HGV克隆株經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可能是肝細(xì)胞親嗜性的。HGV與HCV同屬于黃病毒家族，其基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制機(jī)理也非常相似。用外源基因neo代替HCV的結(jié)構(gòu)基因區(qū)，并插入ECMV IRES直接翻譯HCV的非結(jié)構(gòu)基因區(qū)，由此建立的HCV亞基因組復(fù)制子能夠在體外培養(yǎng)細(xì)胞中自主持久復(fù)制和表達(dá)。因此，我們嘗試將HGV基因組進(jìn)行適當(dāng)改造，用外源報(bào)告基因或治療基因代替HGV的結(jié)構(gòu)基因，并插入篩選標(biāo)志抗性基因neo，兩者間直接用ECMV IRES連接，保留HGV的非結(jié)構(gòu)基因，由此建立HGV亞基因組復(fù)制子，研究其在穩(wěn)定表達(dá)HGV結(jié)構(gòu)蛋白的體外培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制、表達(dá)和病毒的包裝，探索將病毒構(gòu)建成能自主復(fù)制并且具有肝組織靶向性的一類新型載體，以期用于肝病的基因治療。 1、建立穩(wěn)定表達(dá)HGV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞株 以pHGVqz質(zhì)粒為模板，用PCR方法... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：131 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

pvAx.EH上游的部分測序結(jié)果

約45000和20000處有不同于對照細(xì)胞的蛋白條帶，大小與HGVEI、E2蛋白接近(圖l一8)。用鼠抗HGVEZ的單抗進(jìn)行WeSternblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在45000大小處有一特異性條帶(圖1一9)。用HGVRNA陽性血清作為一抗進(jìn)行we:ternblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在45000大小處有一特異性條帶，另外比66000大的地方也有一條不同于對照細(xì)胞的條帶，應(yīng)是HGV結(jié)構(gòu)蛋白酶切前的

第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文第一部分第一節(jié)中間體(圖1一10)。Fig.l一7Assayofthetr出招criPtionol-H行Vstructt叮algenes衍Rl’-PCRmethodMI:DNAM田上erDL15000bP;MZ:DNAM出ternLZ000bp;l:陰性對照;2:未轉(zhuǎn)染HGV結(jié)構(gòu)蛋白Huh7細(xì)胞的Rl’-PCR;3:轉(zhuǎn)染了HGV結(jié)構(gòu)蛋白H曲7細(xì)胞的Rl:PCR;4:HGV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒的陽性對照。圖1一8.HGV結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的SDS一PAGE電泳Fig.l一8ExPressionofHGVstructuralProteinsbySDS一PAGEM:Prote認(rèn)M田上er，Middie;l:未轉(zhuǎn)染HGV結(jié)構(gòu)蛋白的Huh7細(xì)胞;2:轉(zhuǎn)染HGV結(jié)構(gòu)蛋白的Huh7細(xì)胞。圖1一9.HGV結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的叭觸sternblot(EZMAb)Fig.l一9AssayoftheexPressionofHGVs位ucti叮alProtoinsby叭/estemblotwithHGVEZMAbM，ROteinMarke嘰誦ddle;l，Huh一7一EH細(xì)胞;2，轉(zhuǎn)染pvAXI.o空載體的Huh一7細(xì)胞;3，Huh一7細(xì)胞。圖1一10.HGV結(jié)構(gòu)蛋白真核表達(dá)的叭觸stemblot(HGVRNA陽性血清為抗體)Fig.l一10Ass即oftheexPressionofHGVstrueh址a】proteinsbyw匕stemblotwithHGV-positiveserumM:中分子量蛋白Marker;1:轉(zhuǎn)染HGV結(jié)構(gòu)蛋白細(xì)胞表達(dá);2:未轉(zhuǎn)染HGV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞對照。


本文編號：3441311