目的通過為分枝桿菌重組工程系統(tǒng)（pJV53）加篩選標記,建立一種分枝桿菌突變株的篩選方法。方法為pJV53加入蔗糖反篩選基因SacB和突變的潮霉素抗性基因hyg^S,通過潮霉素抗性恢復指示恥垢分枝桿菌（Ms）體內(nèi)同源重組的成功,為突變株的篩選提供標記;通過蔗糖反篩選挑選脫去質(zhì)粒的突變株。結(jié)果成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pJV53-SacB-hyg^S,篩選出MSMEG₄487 G188A突變株以及利福平耐藥的Ms rpoB D516Y和Ms rpoB H526Q突變株,并成功將以上突變株脫去質(zhì)粒。結(jié)論 pJV53-SacB-hyg^S能夠有效幫助構(gòu)建篩選突變株,并對突變株進行脫質(zhì)粒操作,具有普遍應用價值;結(jié)核分枝桿菌rpoB基因D516Y和H526Q的突變與該菌對利福平的耐藥有關(guān)。 

【文章來源】：四川大學學報(醫(yī)學版). 2019,50(05)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

圖１ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ構(gòu)建示意圖Ｆｉｇ１ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓｃｈｅｍｅｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ．Ｔｈｅｍｕｔａｎｔ

結(jié)果２．１ＳａｃＢ擴增和構(gòu)建ｈｙｇＳＰＣＲ擴增ＳａｃＢ，目的片段大小約１７１６ｂｐ，未見非特異性擴增帶，與基因ＳａｃＢ（包括其啟動子區(qū)）大小一致。重疊延伸ＰＣＲ構(gòu)建帶有終止密碼突變的基因片段ｈｙｇＳ，電泳結(jié)果顯示，目的片段大小約１６２６ｂｐ，未見非特異性擴增帶，與潮霉素抗性基因ｈｙｇＲ（包括其啟動子區(qū)）大小一致，表明上下游片段重疊延伸成功；測序結(jié)果顯示帶有終止密碼突變的ｈｙｇＳ構(gòu)建成功（圖２）。圖２重疊延伸ＰＣＲ產(chǎn)物ｈｙｇＳ測序結(jié)果比對Ｆｉｇ２ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＳＯＥ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｈｙｇＳ２．２構(gòu)建ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ轉(zhuǎn)化進ＤＨ５α后，篩選出陽性克隆（圖３Ａ）；質(zhì)粒酶切驗證，ＳｐｅⅠ共酶切出兩條大小約為８８０１ｂｐ、１６２６ｂｐ的條帶，分別與ｐＪＶ５３、ｈｙｇＳ大小一致，標志著重組質(zhì)粒ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ構(gòu)建成功（圖３Ｂ）。以ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ為載體，經(jīng)酶切和連接得到的重組質(zhì)粒ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ轉(zhuǎn)化進ＤＨ５α后，篩選出陽性克�。▓D３Ｃ）；酶切驗證，ＸｂａⅠ共切出兩條大小約為１０４２７ｂｐ和１７１６ｂｐ的條帶，分別與ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ以及ＳａｃＢ大小一致，標志著重組質(zhì)粒ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ構(gòu)建成功（圖３Ｄ）。２．３潮霉素抗性恢復驗證及點突變株的

四川大學學報（醫(yī)學版）第５０卷圖３重組質(zhì)粒ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ的構(gòu)建Ｆｉｇ３ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳＭ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；ＰＣ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｐ１：ＴｈｅｃｏｌｏｎｙＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ；Ｐ２：ＴｈｅＳｐｅⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ；Ｐ３：ＴｈｅｃｏｌｏｎｙＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ；Ｐ４：ＴｈｅＸｂａⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ；Ｐ５：ＴｈｅＸｂａⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ７Ｈ１０培養(yǎng)基，耐藥克隆長出，表明潮霉素抗性標記構(gòu)建成功。將ＲＩＦ１６、ＲＩＦ２６轉(zhuǎn)化經(jīng)乙酰胺誘導的Ｍｓ＿ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ感受態(tài)，涂板含３０μｇ／ｍＬ利福平的７Ｈ１０培養(yǎng)基；將ｏｌｉｇｏ４４８７與ｏｌｉｇｏＨｙｇＲ共轉(zhuǎn)化經(jīng)乙酰胺誘導的Ｍｓ＿ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ感受態(tài)，涂板含１００μｇ／ｍＬ潮霉素的７Ｈ１０培養(yǎng)基。耐藥克隆突變率見表１。培養(yǎng)基上均長出耐藥克隆，測序結(jié)果證明（圖４），所構(gòu)建突變成功。２．４ＳａｃＢ的功能驗證及突變株反篩選蔗糖反篩選結(jié)果顯示（圖５），Ｍｓ＿ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ和Ｍｓ＿ｐＪＶ５３在不含蔗


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