人博卡病毒（Human bocavirusl, HBoV1）是從下呼吸道感染幼兒樣本中檢測(cè)到的一種新細(xì)小病毒。全基因序列分析表明,該病毒與牛細(xì)小病毒（BPV）、犬細(xì)小病毒（MVC）及新發(fā)現(xiàn)的豬博卡病毒（PBoV）,歸屬于細(xì)小病毒亞科博卡病毒屬。眾多研究表明,HBoV1在世界范圍內(nèi)引起兒童下呼吸道感染,患者主要是2歲以下嬰幼兒,臨床癥狀主要表現(xiàn)急性呼吸道哮喘和肺炎。隨后另三種不同基因型HBoV2、HBoV3和HBoV4在胃腸道疾病患者的糞便中發(fā)現(xiàn),表明博卡病毒不僅是呼吸道感染的病原體,還可能還會(huì)引發(fā)病毒性腸胃炎疾病。HBoV1基因全長(zhǎng)約5.5kb,兩個(gè)主要的開放閱讀框分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和衣殼蛋白VP1和VP2,同時(shí)還有第三個(gè)閱讀框編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP1。NP1為博卡病毒屬所特有,序列高度保守,博卡病毒屬成員HBoV1、BPV和MVC的NP1蛋白氨基酸序列同一性達(dá)47%。由于缺乏傳統(tǒng)體外培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物模型,對(duì)人類博卡病毒的研究多集中于流行病學(xué),而在HBoV1的分子生物學(xué)及病毒致病機(jī)制的研究報(bào)道甚少。因此本文主要針對(duì)HBoV1特有蛋白NP1功能展開研究,為闡明蛋白在HBoV1致病機(jī)理提供... 

【文章來源】：華中師范大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：128 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 引言
    1.2 細(xì)小病毒科簡(jiǎn)介
    1.3 人博卡病毒簡(jiǎn)介
        1.3.1 人博卡病毒的生物特性及診斷方法
        1.3.2 人博卡病毒的流行病學(xué)特性
        1.3.3 人博卡病毒與其他病毒共感染的特性
        1.3.4 人博卡病毒感染的臨床癥狀
    1.4 人博卡病毒的分子生物學(xué)特性
        1.4.1 人博卡病毒基因組特征
        1.4.2 人博卡病毒轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制研究
        1.4.3 人博卡病毒蛋白基因功能研究
    1.5 細(xì)小病毒與細(xì)胞死亡及細(xì)胞阻滯
        1.5.1 紅細(xì)胞病毒屬—B19
        1.5.2 博卡病毒屬—HBoV、MVC、BPV
        1.5.3 水貂阿留申病病毒屬—AMDV
        1.5.4 依賴病毒屬—AAV
        1.5.5 細(xì)小病毒屬—MVM、H-1PV
    1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及炎癥因子
        1.6.1 NF-κB
        1.6.2 STAT家族
        1.6.3 AP-1
        1.6.4 TNF-α
        1.6.5 IL-6
    1.7 CHECKMATE~(TM)哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介
    1.8 T7噬菌體展示技術(shù)簡(jiǎn)介
    1.9 研究目的和意義
第二章 人博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NPl誘導(dǎo)HELA細(xì)胞阻滯及細(xì)胞凋亡
    2.1 材料與方法
        2.1.1 載體、菌株與細(xì)胞系
        2.1.2 主要試劑與儀器
        2.1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.4 轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法)
        2.1.5 免疫熒光與Western blotting
        2.1.6 DAPI與JC-1染色
        2.1.7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期
        2.1.8 酶活性分析
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.2.1 目的蛋白NP1在Hela細(xì)胞中表達(dá)
        2.2.2 NP1誘導(dǎo)Hela細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡
        2.2.3 NP1誘導(dǎo)細(xì)胞依賴于caspase活性的細(xì)胞凋亡
        2.2.4 NP1通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
        2.2.5 NP1的N末端對(duì)細(xì)胞凋亡起至關(guān)重要的作用
    2.3 討論
第三章 人博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.3 免疫熒光和Western blot分析
        3.1.4 熒光素酶雙報(bào)告基因活性測(cè)定
        3.1.5 ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL6和TNF-α的表達(dá)
        3.1.6 哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)
        3.1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 目的蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)
        3.2.3 HBoV1 NP1上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-1、STAT3及STATl的活性,對(duì)NF-κB活性無影響
        3.2.4 NP1對(duì)炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)的影響
        3.2.5 單獨(dú)表達(dá)的NP1蛋白不存在自身相互作用
        3.2.6 HBoV1 NS1上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-1、STAT3及NF-κB的活性,對(duì)STAT1活性無影響
    3.3 討論
第四章 人博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NP1核定位信號(hào)分析
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.3 轉(zhuǎn)染、熒光顯微鏡觀察
        4.1.4 免疫熒光與Western blotting
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 NP1融合蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位
        4.2.2 NP1 C末端和兩端截短定位情況
        4.2.3 NP1 N末端截短蛋白在細(xì)胞中的定位
        4.2.4 NP1突變蛋白定位情況
    4.3 討論
第五章 人博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NP1與宿主細(xì)胞相互作用蛋白篩選
    5.1 材料和方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 引物的設(shè)計(jì)及合成
        5.1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.1.4 pMAL-NP1的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
        5.1.5 融合蛋白MBP-NP1的純化
        5.1.6 BCA法測(cè)定蛋白濃度(碧云天試劑盒)
        5.1.7 T7噬菌體文庫(kù)擴(kuò)增及空斑測(cè)定噬菌體滴度
        5.1.8 噬菌體的生物篩選
        5.1.9 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫特異性結(jié)合的噬菌體
        5.1.10 噬斑的PCR擴(kuò)增
        5.1.11 克隆載體的構(gòu)建和鑒定
        5.1.12 DNA序列測(cè)序及同源性比對(duì)
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 融合蛋白MBP-NP1的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
        5.2.2 融合蛋白MBP-NP1的純化
        5.2.3 擴(kuò)增后T7人肝cDNA文庫(kù)多樣性分析
        5.2.4 噬菌體生物淘選結(jié)果
        5.2.5 目的基因PCR擴(kuò)增、序列比對(duì)及同源性分析
        5.2.6 測(cè)序數(shù)據(jù)分析
    5.3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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