近年來,RNA疫苗在腫瘤預(yù)防及治療領(lǐng)域的價值愈加重要,不僅因?yàn)槠渚哂辛己玫恼T導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力,而且因?yàn)槠渚哂蠨NA疫苗、蛋白疫苗以及多肽疫苗無可比擬的優(yōu)勢：與DNA疫苗相比,RNA疫苗不存在整合到宿主基因組內(nèi)的可能,安全性較高；與蛋白疫苗相比,RNA疫苗可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答；與多肽疫苗相比,RNA疫苗的免疫原性更強(qiáng)。然而,RNA的穩(wěn)定性限制了其作為疫苗在疾病預(yù)防及治療中的應(yīng)用。盡管現(xiàn)在有多種方式被應(yīng)用于提高RNA的穩(wěn)定性,如對RNA骨架進(jìn)行修飾,脂質(zhì)體或金粒子包裹等,但是這些方法沒有從根本上解決RNA穩(wěn)定性差的問題,且需要經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄過程或合成途徑才能獲得大量的RNA,這種制備過程不僅對生產(chǎn)條件要求較高,而且成本較高。腺病毒載體及復(fù)制子RNA也是目前常用的RNA遞送載體,但病毒載體自身的結(jié)構(gòu)蛋白多樣并且其有重組成新病毒的可能,這使其難以應(yīng)用于臨床。目前臨床研究及應(yīng)用中最有效的傳遞方式是以樹突狀細(xì)胞為靶標(biāo)的RNA疫苗,但是體外樹突狀細(xì)胞的制備成本較高、操作繁瑣,而且自體樹突狀細(xì)胞的來源也有限。此外,microRNA研究及臨床應(yīng)用中還存在細(xì)胞內(nèi)傳遞效率低的問題。鑒于上述RN... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：176 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
英文縮略詞
中文摘要
Abstract
第一部分 基于MS2 VLPs的前列腺癌預(yù)防及治療性mRNA疫苗的研究
    前言
    1. 材料與方法
        1.1. 材料
            1.1.1. 菌株、細(xì)胞系和質(zhì)粒
            1.1.2. 主要試劑
            1.1.3. 溶液的配制
            1.1.4. 儀器及耗材
        1.2. 方法
            1.2.1. pMS2-hPAP-GM-CSF、pMS2-mPAP-GM-CSF等酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.2. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的表達(dá)及純化
            1.2.3. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的鑒定
            1.2.4. CCK法檢測細(xì)胞毒性
            1.2.5. hPAP-GM-CSF VLPs免疫刺激活性的檢測
            1.2.6. VLPs包裹的mRNA體外翻譯能力及清除速率的分析
            1.2.7. mRNA疫苗接種
            1.2.8. ELISA法檢測抗體效價
            1.2.9. T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
            1.2.10. ELISA法和ELISPOT法檢測細(xì)胞因子
            1.2.11. FACS法檢測樹突狀細(xì)胞(DCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)
            1.2.12. 腫瘤接種及腫瘤大小檢測
            1.2.13. 統(tǒng)計學(xué)分析
    2. 結(jié)果
        2.1. pMS2-hPAP-GM-CSF、pMS2-mPAP-GM-CSF等酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的表達(dá)及純化
        2.3. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的鑒定
        2.4. VLPs包裹的mRNA體外翻譯能力及清除速率的分析
        2.5. hPAP-GM-CSF VLPs的細(xì)胞毒性及免疫刺激能力的分析
        2.6. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗對DCs的激活作用
        2.7. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答
        2.8. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答
        2.9. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響
        2.10. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗腫瘤預(yù)防效果的評估
        2.11. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗腫瘤治療效果的評估
    3. 討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 基于MS2 VLPs的前列腺癌治療性microRNA疫苗的初步研究
    前言
    1. 材料與方法
        1.1. 材料
            1.1.1. 菌株、細(xì)胞系和質(zhì)粒
            1.1.2. 主要試劑
            1.1.3. 溶液的配制
            1.1.4. 儀器及耗材
        1.2. 方法
            1.2.1. p2MS2-microRNA-23a、p2MS2-microRNA-23b等酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.2. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的表達(dá)及純化
            1.2.3. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs的鑒定
            1.2.4. CCK法檢測細(xì)胞毒性
            1.2.5. TAT-mRNA VLPs及TAT-microRNA VLPs體外翻譯能力的分析
            1.2.6. FACS法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡
            1.2.7. 統(tǒng)計學(xué)分析
    2. 結(jié)果
        2.1. p2MS2-microRNA-23a、p2MS2-microRNA-23b等酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的表達(dá)及純化
        2.3. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的鑒定
        2.4. TAT-microRNA-23a VLPs的細(xì)胞毒性分析
        2.5. 攜帶TAT的VLPs包裹的RNA體外翻譯能力的分析
        2.6. TAT-microRNA-23a VLPs體外抗腫瘤效果的評價
    3. 討論
    參考文獻(xiàn)
論文綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄1 pESC-URA載體信息
附錄2 pGEM~(?)-T Easy載體信息
附錄3 重組表達(dá)載體pMS2測序和序列比對結(jié)果
附錄4 重組表達(dá)載體pMS2p測序和序列比對結(jié)果
附錄5 重組表達(dá)載體pMS2-hPAP測序和序列比對結(jié)果
附錄6 重組表達(dá)載體pMS2-mPAP測序和序列比對結(jié)果
附錄7 重組表達(dá)載體pMS2-GM-CSF測序和序列比對結(jié)果
附錄8 重組表達(dá)載體pMS2-hPAP-GM-CSF測序和序列比對結(jié)果
附錄9 重組表達(dá)載體pMS2-mPAP-GM-CSF測序和序列比對結(jié)果
附錄10 重組表達(dá)載體p2MS2測序和序列比對結(jié)果
附錄11 重組表達(dá)載體p2MS2-GM-CSF測序和序列比對結(jié)果
附錄12 重組表達(dá)載體p2MS2-GFP測序和序列比對結(jié)果
附錄13 重組表達(dá)載體p2MS2-microRNA-23a測序和序列比對結(jié)果
附錄14 重組表達(dá)載體p2MS2-microRNA-23b測序和序列比對結(jié)果
附錄15 重組表達(dá)載體p2MS2-microRNA-con測序和序列比對結(jié)果
致謝
個人簡介



本文編號：3425316