目的對(duì)華支睪吸蟲一氧化氮合酶相互作用蛋白（CsNOSIP）進(jìn)行克隆和原核表達(dá),初步了解其重組產(chǎn)物的免疫學(xué)功能。方法從華支睪吸蟲基因文庫中獲得CsNOSIP的全長cDNA并克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）中,誘導(dǎo)表達(dá)后用親和層析柱進(jìn)行純化,用純化的rCsNOSIP及rCsNOSIP蛋白免疫BALB/c小鼠以獲得rCsNOSIP免疫血清,采用Western blot鑒定重組蛋白CsNOSIP的表達(dá)及其反應(yīng)原性;采用ELISA檢測(cè)rCsNOSIP免疫小鼠血清特異性抗體亞類水平。結(jié)果 CsNOSIP基因的開放閱讀框（ORF）包含867 bp,編碼288個(gè)氨基酸,PCR、雙酶切及DNA測(cè)序表明pET-30a（+）-CsNOSIP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白在大腸埃希菌BL21/DE3中獲得高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為35×10³;經(jīng)親和層析法獲得高純度的重組蛋白,該蛋白可被His單抗、CsNOSIP免疫小鼠血清、感染華支睪吸蟲小鼠血清及ESP免疫血清識(shí)別,重組蛋白免疫血清能識(shí)別CsESP;ELISA檢測(cè)顯示rCsNOSIP免疫小鼠血清特異抗體滴度... 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(07)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

圖１重組質(zhì)粒ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）的雙酶切鑒定ＬａｎｅＭ１ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００Ｌａｎｅ１ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｍ－Ｍ１、１、２、３、Ｍ２分別為ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００、ＰＣＲ產(chǎn)物、重組質(zhì)粒雙酶切、ｐＥＴ－３０ａ（＋）

件（溫度３０℃，ＩＰＴＧ濃度為０．２ｍｍｏｌ／Ｌ誘導(dǎo)３ｈ）進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示純化蛋白分子量約為３５×１０３條帶（圖２），同時(shí)證明融合蛋白主要以可溶性形式表達(dá)。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測(cè)得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為１．２５ｍｇ／ｍｌ。Ｍ、１、２、３、４、５、６、７分別為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量、空質(zhì)粒誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后，上清，沉淀和純化的蛋白圖２ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）轉(zhuǎn)染大腸埃希菌ＢＬ２１／ＤＥ３表達(dá)的重組蛋白及其純化產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒＬａｎｅ１ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ２ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ３ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ４ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ５ＳｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ６ＩｎｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ７ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓ

１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后轉(zhuǎn)膜，分別以ａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰ血清和ａｎｔｉ－ｒＣｓ－ＮＯＳＩＰ血清為一抗進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，結(jié)果見圖５。重組蛋白免疫血清能識(shí)別ＣｓＥＳＰ，抗ＥＳＰ免疫血清也能識(shí)別重組蛋白，而ＣｓＥＳＰ、ｒＣｓＮＯＳＩＰ不與免疫前小鼠血清反應(yīng)。１、３為ＣｓＥＳＰ、ＣｓＮＯＳＩＰ與陰性小鼠血清識(shí)別２、４分別為ＣｓＥＳＰ與重組蛋白免疫小鼠血清識(shí)別；ＣｓＮＯＳＩＰ與ＣｓＥＳＰ蛋白免疫小鼠血清識(shí)別圖５ＣｓＮＯＳＩＰ中ＣｓＥＳＰ成分的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定Ｌａｎｅ１Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｅｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ２Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＮＯＳＩＰｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ３ｒＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰｓｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＦｉｇ．５ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｓＮＯＳＩＰａｓａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆＣｓＥＳＰｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ８ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗體水平及亞型檢測(cè)采用ＥＬＩＳＡ檢測(cè)ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗體滴度為１∶２５６００，ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平均與對(duì)照組比較顯著升高，且ＩｇＧ１水平高于ＩｇＧ２ａ（ｔ＝１５．１９，Ｐ＜０．０５）（圖６）。討論華支睪吸蟲成蟲寄生在人體肝臟膽管內(nèi)，可引起膽管上皮細(xì)胞脫落、增生，局限性擴(kuò)張，膽管上皮細(xì)胞有不同程度的腺瘤樣增生及結(jié)締組織增生，誘發(fā)膽

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]華支睪吸蟲感染FVB小鼠不同組織CD4+T細(xì)胞TLR4表達(dá)變化[J]. 李向陽,顏超,杜瑩,于倩,華慧,湯仁仙,鄭葵陽.  中國病原生物學(xué)雜志. 2018(05)
[2]內(nèi)皮型一氧化氮合酶在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用[J]. 徐啟華,曹濟(jì)民.  醫(yī)學(xué)研究雜志. 2010(08)



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