華支睪吸蟲NOSIP基因的克隆表達及免疫學鑒定
發(fā)布時間：2021-10-08 08:25
目的對華支睪吸蟲一氧化氮合酶相互作用蛋白（CsNOSIP）進行克隆和原核表達,初步了解其重組產物的免疫學功能。方法從華支睪吸蟲基因文庫中獲得CsNOSIP的全長cDNA并克隆至原核表達質粒pET-30a（+）中,誘導表達后用親和層析柱進行純化,用純化的rCsNOSIP及rCsNOSIP蛋白免疫BALB/c小鼠以獲得rCsNOSIP免疫血清,采用Western blot鑒定重組蛋白CsNOSIP的表達及其反應原性;采用ELISA檢測rCsNOSIP免疫小鼠血清特異性抗體亞類水平。結果 CsNOSIP基因的開放閱讀框（ORF）包含867 bp,編碼288個氨基酸,PCR、雙酶切及DNA測序表明pET-30a（+）-CsNOSIP重組質粒構建成功。SDS-PAGE檢測目的蛋白在大腸埃希菌BL21/DE3中獲得高效表達,表達產物相對分子質量為35×103;經親和層析法獲得高純度的重組蛋白,該蛋白可被His單抗、CsNOSIP免疫小鼠血清、感染華支睪吸蟲小鼠血清及ESP免疫血清識別,重組蛋白免疫血清能識別CsESP;ELISA檢測顯示rCsNOSIP免疫小鼠血清特異抗體滴度...
【文章來源】：中國病原生物學雜志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：5 頁
【部分圖文】：
圖１重組質粒ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）的雙酶切鑒定ＬａｎｅＭ１ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００Ｌａｎｅ１ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｍ－Ｍ１、１、２、３、Ｍ２分別為ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００、ＰＣＲ產物、重組質粒雙酶切、ｐＥＴ－３０ａ（＋）
件（溫度３０℃，ＩＰＴＧ濃度為０．２ｍｍｏｌ／Ｌ誘導３ｈ）進行大量誘導表達，對重組蛋白進行純化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示純化蛋白分子量約為３５×１０３條帶（圖２），同時證明融合蛋白主要以可溶性形式表達。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測得純化產物的蛋白濃度為１．２５ｍｇ／ｍｌ。Ｍ、１、２、３、４、５、６、７分別為蛋白質標準分子量、空質粒誘導前、誘導后，重組質粒誘導前、誘導后，上清，沉淀和純化的蛋白圖２ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）轉染大腸埃希菌ＢＬ２１／ＤＥ３表達的重組蛋白及其純化產物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒＬａｎｅ１ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ２ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ３ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ４ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ５ＳｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ６ＩｎｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ７ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓ
１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后轉膜，分別以ａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰ血清和ａｎｔｉ－ｒＣｓ－ＮＯＳＩＰ血清為一抗進行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，結果見圖５。重組蛋白免疫血清能識別ＣｓＥＳＰ，抗ＥＳＰ免疫血清也能識別重組蛋白，而ＣｓＥＳＰ、ｒＣｓＮＯＳＩＰ不與免疫前小鼠血清反應。１、３為ＣｓＥＳＰ、ＣｓＮＯＳＩＰ與陰性小鼠血清識別２、４分別為ＣｓＥＳＰ與重組蛋白免疫小鼠血清識別；ＣｓＮＯＳＩＰ與ＣｓＥＳＰ蛋白免疫小鼠血清識別圖５ＣｓＮＯＳＩＰ中ＣｓＥＳＰ成分的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定Ｌａｎｅ１Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｅｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ２Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＮＯＳＩＰｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ３ｒＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰｓｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＦｉｇ．５ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｓＮＯＳＩＰａｓａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆＣｓＥＳＰｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ８ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗體水平及亞型檢測采用ＥＬＩＳＡ檢測ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗體滴度為１∶２５６００，ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平均與對照組比較顯著升高，且ＩｇＧ１水平高于ＩｇＧ２ａ（ｔ＝１５．１９，Ｐ＜０．０５）（圖６）。討論華支睪吸蟲成蟲寄生在人體肝臟膽管內，可引起膽管上皮細胞脫落、增生，局限性擴張，膽管上皮細胞有不同程度的腺瘤樣增生及結締組織增生，誘發(fā)膽
【參考文獻】：
期刊論文
[1]華支睪吸蟲感染FVB小鼠不同組織CD4+T細胞TLR4表達變化[J]. 李向陽,顏超,杜瑩,于倩,華慧,湯仁仙,鄭葵陽. 中國病原生物學雜志. 2018(05)
[2]內皮型一氧化氮合酶在動脈粥樣硬化中的作用[J]. 徐啟華,曹濟民. 醫(yī)學研究雜志. 2010(08)
本文編號：3423793
【文章來源】：中國病原生物學雜志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：5 頁
【部分圖文】：
圖１重組質粒ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）的雙酶切鑒定ＬａｎｅＭ１ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００Ｌａｎｅ１ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｍ－Ｍ１、１、２、３、Ｍ２分別為ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００、ＰＣＲ產物、重組質粒雙酶切、ｐＥＴ－３０ａ（＋）
件（溫度３０℃，ＩＰＴＧ濃度為０．２ｍｍｏｌ／Ｌ誘導３ｈ）進行大量誘導表達，對重組蛋白進行純化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示純化蛋白分子量約為３５×１０３條帶（圖２），同時證明融合蛋白主要以可溶性形式表達。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測得純化產物的蛋白濃度為１．２５ｍｇ／ｍｌ。Ｍ、１、２、３、４、５、６、７分別為蛋白質標準分子量、空質粒誘導前、誘導后，重組質粒誘導前、誘導后，上清，沉淀和純化的蛋白圖２ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）轉染大腸埃希菌ＢＬ２１／ＤＥ３表達的重組蛋白及其純化產物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒＬａｎｅ１ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ２ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ３ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ４ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ５ＳｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ６ＩｎｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ７ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓ
１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后轉膜，分別以ａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰ血清和ａｎｔｉ－ｒＣｓ－ＮＯＳＩＰ血清為一抗進行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，結果見圖５。重組蛋白免疫血清能識別ＣｓＥＳＰ，抗ＥＳＰ免疫血清也能識別重組蛋白，而ＣｓＥＳＰ、ｒＣｓＮＯＳＩＰ不與免疫前小鼠血清反應。１、３為ＣｓＥＳＰ、ＣｓＮＯＳＩＰ與陰性小鼠血清識別２、４分別為ＣｓＥＳＰ與重組蛋白免疫小鼠血清識別；ＣｓＮＯＳＩＰ與ＣｓＥＳＰ蛋白免疫小鼠血清識別圖５ＣｓＮＯＳＩＰ中ＣｓＥＳＰ成分的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定Ｌａｎｅ１Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｅｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ２Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＮＯＳＩＰｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ３ｒＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰｓｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＦｉｇ．５ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｓＮＯＳＩＰａｓａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆＣｓＥＳＰｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ８ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗體水平及亞型檢測采用ＥＬＩＳＡ檢測ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗體滴度為１∶２５６００，ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平均與對照組比較顯著升高，且ＩｇＧ１水平高于ＩｇＧ２ａ（ｔ＝１５．１９，Ｐ＜０．０５）（圖６）。討論華支睪吸蟲成蟲寄生在人體肝臟膽管內，可引起膽管上皮細胞脫落、增生，局限性擴張，膽管上皮細胞有不同程度的腺瘤樣增生及結締組織增生，誘發(fā)膽
【參考文獻】：
期刊論文
[1]華支睪吸蟲感染FVB小鼠不同組織CD4+T細胞TLR4表達變化[J]. 李向陽,顏超,杜瑩,于倩,華慧,湯仁仙,鄭葵陽. 中國病原生物學雜志. 2018(05)
[2]內皮型一氧化氮合酶在動脈粥樣硬化中的作用[J]. 徐啟華,曹濟民. 醫(yī)學研究雜志. 2010(08)
本文編號：3423793
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/shiyanyixue/3423793.html
最近更新
教材專著
