本文關(guān)鍵詞：RIP3功能啟動(dòng)子的鑒定及其調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的：受體相互作用蛋白激酶3（Receptor-Interacting ProteinKinase-3, RIPK3or RIP3）參與腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)或Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)介導(dǎo)的細(xì)胞壞死信號(hào)通路，有文章報(bào)道RIP3在細(xì)胞凋亡中也起到調(diào)控作用。研究表明，RIP3介導(dǎo)的細(xì)胞壞死在胰腺炎等疾病中發(fā)揮重要作用。因此，對(duì)于RIP3表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究具有十分重要的意義，但是至今為止關(guān)于RIP3的調(diào)控機(jī)理研究尚未報(bào)道。因此，本課題旨在研究RIP3轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，鑒定核心啟動(dòng)子區(qū)域并對(duì)其調(diào)控機(jī)制做進(jìn)一步研究。 研究方法： （1）通過檢測(cè)細(xì)胞活力檢測(cè)不同結(jié)腸癌細(xì)胞系對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性； （2）利用蛋白免疫印跡檢測(cè)不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中RIP3的表達(dá)水平； （3）利用熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)RIP3啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行活性分析； （4）利用過表達(dá)系統(tǒng)在293T細(xì)胞中驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子Sp1蛋白對(duì)RIP3啟動(dòng)子活性的影響； （5）利用RNAi技術(shù)在293T細(xì)胞中驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子Sp1蛋白對(duì)RIP3啟動(dòng)子活性的影響； （6）利用EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Sp1與RIP3啟動(dòng)子區(qū)域的相互作用； （7）通過檢測(cè)細(xì)胞活力檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)Sp1-shRNA的HT-29細(xì)胞系對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的敏感性； （8）利用BSP方法檢測(cè)RIP3啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。 研究結(jié)果： （1）不同結(jié)腸癌細(xì)胞系對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的敏感性不同。誘導(dǎo)不同結(jié)腸癌細(xì)胞系發(fā)生TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，通過檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的敏感性不同。 （2）不同結(jié)腸癌細(xì)胞中RIP3的表達(dá)水平有差異。通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性與結(jié)腸癌細(xì)胞中RIP3的表達(dá)水平呈正相關(guān)。 （3）RIP3啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)域集中在5’非翻譯區(qū)(5’-non-translated region,5’UTR)區(qū)域以及5’UTR上游19個(gè)堿基片段。通過構(gòu)建含有RIP3啟動(dòng)子區(qū)域不同長(zhǎng)度片段的重組質(zhì)粒，在293T細(xì)胞中進(jìn)行熒光素雙報(bào)告基因系統(tǒng)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RIP3啟動(dòng)子活性關(guān)鍵區(qū)域包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19個(gè)堿基片段。 （4）轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)對(duì)RIP3啟動(dòng)子活性起到關(guān)鍵調(diào)控作用。通過對(duì)包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19個(gè)堿基片段序列分析，發(fā)現(xiàn)該段序列含有三個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)，，通過對(duì)這三個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)第二個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)對(duì)RIP3啟動(dòng)子活性調(diào)控起到關(guān)鍵作用。 （5）Sp1調(diào)控RIP3啟動(dòng)子活性。在293T細(xì)胞中過表達(dá)Sp1可以促進(jìn)RIP3啟動(dòng)子活性，轉(zhuǎn)染針對(duì)Sp1的siRNA降低Sp1的表達(dá)后，RIP3基因的轉(zhuǎn)錄活性降低。 （6）Sp1結(jié)合到RIP3啟動(dòng)子區(qū)域。EMSA以及CHIP實(shí)驗(yàn)顯示Sp1與RIP3的啟動(dòng)子區(qū)域相互結(jié)合，而且這種結(jié)合可以被Sp1抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制； （7）低表達(dá)Sp1的HT-29細(xì)胞對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性降低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)Sp1-shRNA的HT-29細(xì)胞系對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性降低。 （8）在不表達(dá)RIP3的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中，反式作用因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生甲基化，抑制RIP3的轉(zhuǎn)錄。對(duì)RIP3啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾后，然后進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)在不表達(dá)RIP3的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中，RIP3啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化。 結(jié)論： 我們首次報(bào)道了RIP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理，發(fā)現(xiàn)Sp1在結(jié)腸癌細(xì)胞中調(diào)控RIP3基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響其對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的敏感性。在一些不表達(dá)RIP3的結(jié)腸癌細(xì)胞系中，RIP3啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化，從而抑制了RIP3基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在臨床治療相關(guān)疾病中，可以通過靶向RIP3啟動(dòng)子區(qū)域的Sp1結(jié)合位點(diǎn)或甲基化位點(diǎn)，研發(fā)特異性藥物調(diào)控RIP3的表達(dá)，進(jìn)而緩解疾病癥狀并達(dá)到治療效果。
【關(guān)鍵詞】：受體相互作用蛋白激酶3 轉(zhuǎn)錄活性 啟動(dòng)子 甲基化
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-29
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料13-19
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法19-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-38
• 1. 結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì) TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性與細(xì)胞中 RIP3 的表達(dá)呈正相關(guān)29-30
• 2. 5'UTR 區(qū)域 Sp1 結(jié)合區(qū)域調(diào)控 RIP3 啟動(dòng)子活性30-32
• 3. RIP3 啟動(dòng)子區(qū)域的 Sp1 結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控 RIP3 啟動(dòng)子活性32-34
• 4. Sp1 結(jié)合至 RIP3 啟動(dòng)子區(qū)域34-35
• 5. 低表達(dá) Sp1 的 HT-29 細(xì)胞系對(duì) TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性降低35-36
• 6. 啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化調(diào)控 RIP3 的表達(dá)36-38
• 總結(jié)38-39
• 結(jié)論與討論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 綜述42-55
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 攻讀學(xué)位期間本人出版和公開發(fā)表的論著、論文55-56
• 致謝56-58

【相似文獻(xiàn)】

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1 郭亞兵,戴煒,盧橋生,侯金林,馮筱榕,駱抗先;重型乙型肝炎病毒C基因啟動(dòng)子變異[J];中華傳染病雜志;1999年02期

2 齊永;高江平;李琦;洪寶發(fā);伍志強(qiáng);趙亞力;;阿司匹林對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶9啟動(dòng)子活性的影響[J];中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2005年10期

3 王軍利;張惠中;白萬勝;劉麗;卞卡;成詩銀;;喉癌組織中TSLC1基因啟動(dòng)子過甲基化及mRNA表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年07期

4 武圣明,鄒竹英,周向軍,蔡龍榮,溫肇榮;人αB干擾素在Saccharomyce cerevisiae中的合成和分泌[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1988年04期

5 張玉彬;吳梧桐;王e

本文編號(hào)：340837