本文關鍵詞：RIP3功能啟動子的鑒定及其調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的：受體相互作用蛋白激酶3（Receptor-Interacting ProteinKinase-3, RIPK3or RIP3）參與腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)或Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)介導的細胞壞死信號通路，有文章報道RIP3在細胞凋亡中也起到調(diào)控作用。研究表明，RIP3介導的細胞壞死在胰腺炎等疾病中發(fā)揮重要作用。因此，對于RIP3表達調(diào)控機理研究具有十分重要的意義，但是至今為止關于RIP3的調(diào)控機理研究尚未報道。因此，本課題旨在研究RIP3轉錄調(diào)控機制，鑒定核心啟動子區(qū)域并對其調(diào)控機制做進一步研究。 研究方法： （1）通過檢測細胞活力檢測不同結腸癌細胞系對TNF-α誘導的細胞壞死敏感性； （2）利用蛋白免疫印跡檢測不同結腸癌細胞系中RIP3的表達水平； （3）利用熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)對RIP3啟動子區(qū)域進行活性分析； （4）利用過表達系統(tǒng)在293T細胞中驗證轉錄因子Sp1蛋白對RIP3啟動子活性的影響； （5）利用RNAi技術在293T細胞中驗證轉錄因子Sp1蛋白對RIP3啟動子活性的影響； （6）利用EMSA實驗驗證Sp1與RIP3啟動子區(qū)域的相互作用； （7）通過檢測細胞活力檢測穩(wěn)定表達Sp1-shRNA的HT-29細胞系對TNF-α誘導的細胞壞死的敏感性； （8）利用BSP方法檢測RIP3啟動子區(qū)域的甲基化水平。 研究結果： （1）不同結腸癌細胞系對TNF-α誘導的細胞壞死的敏感性不同。誘導不同結腸癌細胞系發(fā)生TNF-α誘導的細胞壞死，通過檢測細胞活力發(fā)現(xiàn)不同細胞系對TNF-α誘導的細胞壞死的敏感性不同。 （2）不同結腸癌細胞中RIP3的表達水平有差異。通過蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)對TNF-α誘導的細胞壞死敏感性與結腸癌細胞中RIP3的表達水平呈正相關。 （3）RIP3啟動子關鍵區(qū)域集中在5’非翻譯區(qū)(5’-non-translated region,5’UTR)區(qū)域以及5’UTR上游19個堿基片段。通過構建含有RIP3啟動子區(qū)域不同長度片段的重組質(zhì)粒，在293T細胞中進行熒光素雙報告基因系統(tǒng)的檢測發(fā)現(xiàn)RIP3啟動子活性關鍵區(qū)域包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19個堿基片段。 （4）轉錄因子Sp1結合位點對RIP3啟動子活性起到關鍵調(diào)控作用。通過對包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19個堿基片段序列分析，發(fā)現(xiàn)該段序列含有三個Sp1結合位點，，通過對這三個Sp1結合位點進行突變，發(fā)現(xiàn)第二個Sp1結合位點對RIP3啟動子活性調(diào)控起到關鍵作用。 （5）Sp1調(diào)控RIP3啟動子活性。在293T細胞中過表達Sp1可以促進RIP3啟動子活性，轉染針對Sp1的siRNA降低Sp1的表達后，RIP3基因的轉錄活性降低。 （6）Sp1結合到RIP3啟動子區(qū)域。EMSA以及CHIP實驗顯示Sp1與RIP3的啟動子區(qū)域相互結合，而且這種結合可以被Sp1抗體競爭性抑制； （7）低表達Sp1的HT-29細胞對TNF-α誘導的細胞壞死敏感性降低。實驗發(fā)現(xiàn)表達Sp1-shRNA的HT-29細胞系對TNF-α誘導的細胞壞死敏感性降低。 （8）在不表達RIP3的結腸癌細胞HCT-116中，反式作用因子Sp1結合位點發(fā)生甲基化，抑制RIP3的轉錄。對RIP3啟動子區(qū)域進行亞硫酸氫鹽修飾后，然后進行測序發(fā)現(xiàn)在不表達RIP3的結腸癌細胞HCT-116中，RIP3啟動子區(qū)域高度甲基化。 結論： 我們首次報道了RIP3的轉錄調(diào)控機理，發(fā)現(xiàn)Sp1在結腸癌細胞中調(diào)控RIP3基因的轉錄進而影響其對TNF-α誘導的細胞壞死的敏感性。在一些不表達RIP3的結腸癌細胞系中，RIP3啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化，從而抑制了RIP3基因的表達。本實驗結果提示在臨床治療相關疾病中，可以通過靶向RIP3啟動子區(qū)域的Sp1結合位點或甲基化位點，研發(fā)特異性藥物調(diào)控RIP3的表達，進而緩解疾病癥狀并達到治療效果。
【關鍵詞】：受體相互作用蛋白激酶3 轉錄活性 啟動子 甲基化
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-29
• 1. 實驗材料13-19
• 2. 實驗方法19-29
• 實驗結果29-38
• 1. 結腸癌細胞對 TNF-α誘導的細胞壞死敏感性與細胞中 RIP3 的表達呈正相關29-30
• 2. 5'UTR 區(qū)域 Sp1 結合區(qū)域調(diào)控 RIP3 啟動子活性30-32
• 3. RIP3 啟動子區(qū)域的 Sp1 結合位點調(diào)控 RIP3 啟動子活性32-34
• 4. Sp1 結合至 RIP3 啟動子區(qū)域34-35
• 5. 低表達 Sp1 的 HT-29 細胞系對 TNF-α誘導的細胞壞死敏感性降低35-36
• 6. 啟動子區(qū)域的甲基化調(diào)控 RIP3 的表達36-38
• 總結38-39
• 結論與討論39-40
• 參考文獻40-42
• 綜述42-55
• 參考文獻50-55
• 攻讀學位期間本人出版和公開發(fā)表的論著、論文55-56
• 致謝56-58

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭亞兵,戴煒,盧橋生,侯金林,馮筱榕,駱抗先;重型乙型肝炎病毒C基因啟動子變異[J];中華傳染病雜志;1999年02期

2 齊永;高江平;李琦;洪寶發(fā);伍志強;趙亞力;;阿司匹林對基質(zhì)金屬蛋白酶9啟動子活性的影響[J];中國臨床藥理學與治療學;2005年10期

3 王軍利;張惠中;白萬勝;劉麗;卞卡;成詩銀;;喉癌組織中TSLC1基因啟動子過甲基化及mRNA表達[J];第四軍醫(yī)大學學報;2007年07期

4 武圣明,鄒竹英,周向軍,蔡龍榮,溫肇榮;人αB干擾素在Saccharomyce cerevisiae中的合成和分泌[J];第二軍醫(yī)大學學報;1988年04期

5 張玉彬;吳梧桐;王e

本文編號：340837