本文關(guān)鍵詞：脂肪基質(zhì)細胞誘導分化為星形膠質(zhì)細胞過程中線粒體凋亡與自噬的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討在ADSCs誘導分化為星形膠質(zhì)細胞過程中線粒體凋亡與自噬的關(guān)系，從而為進一步增加獲得的ADSCs源性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量并延長其存活時間具有重要的科學意義。 方法1參照葉長青等的實驗方法，將成人脂肪組織體外分離、培養(yǎng)為ADSCs，倒置相差顯微鏡下每日觀察ADSCs的形態(tài)學變化。2將傳至第3代的成人ADSCs，應(yīng)用以含IBMX為主要成分的誘導劑誘導其向星形膠質(zhì)細胞分化，按照誘導時間的不同分為誘導48h、7d、14d、21d組，并在倒置相差顯微鏡下觀察誘導后細胞形態(tài)學的變化。3應(yīng)用免疫細胞化學法和Western-blotting分別檢測未誘導的ADSCs及誘導分化48h、7d、14d、21d的星形膠質(zhì)細胞特異性標志蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fbrillary acidic protein, GFAP），，Bcl-2蛋白家族蛋白Bcl-2、Bax及細胞色素C（Cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Cysteine aspartate specificprotease-3）及微管相關(guān)蛋白輕鏈3（Microtubule-associated protein light chain3,LC3）的表達。4流式細胞術(shù)Annexin/PI雙染法檢測未誘導的ADSCs及誘導后48h、7d、14d、21d時細胞的生存狀態(tài)。5透射電子顯微鏡下觀察誘導后14d的星形膠質(zhì)細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、凋亡及自噬現(xiàn)象。6MTT法檢測ADSCs誘導分化為星形膠質(zhì)細胞過程中細胞的生長狀態(tài)。7統(tǒng)計學方法：所得實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel2003數(shù)據(jù)庫整理，采用統(tǒng)計軟件包SPSS17.0進行分析，數(shù)據(jù)均以（x s）表示，不同時間點間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果1提取的原代ADSCs于24h時已貼壁，倒置相差顯微鏡下可見細胞呈三角形、短梭形。培養(yǎng)至7~10d時可見大量呈漩渦狀排列的長梭形細胞。2誘導反應(yīng)48h時，細胞折光性增強，部分細胞的胞體周圍伸出細長突起，并有多個分支。誘導反應(yīng)7d時，細胞胞體折光性顯著增強，部分細胞呈現(xiàn)典型的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)，并交織成網(wǎng)狀。誘導14d時，細胞胞體折光性較7d時更加增強，但細胞形態(tài)與7d時無明顯變化。誘導21d時，細胞數(shù)量減少，細胞的突起較誘導14d時變短、變少。3免疫細胞化學結(jié)果顯示GFAP在未誘導的ADSCs中無陽性表達，而在誘導后各時間點均可見陽性表達細胞，且在細胞體和突起部位的細胞質(zhì)均呈陽性表達，GFAP的細胞陽性表達率僅7d與14d無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），至誘導7d時GFAP的陽性表達率達到高峰（P＜0.05）。Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-3和LC3在未誘導的ADSCs和誘導反應(yīng)的各時間點均可見陽性表達，而且陽性表達部位主要位于細胞核周圍的細胞漿，而突起部位沒有見到明顯的陽性表達。Bcl-2的陽性表達率隨著誘導時間的延長逐漸降低（P＜0.05），在未誘導的ADSCs和誘導后各時間點僅7d與14d無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的陽性表達率在未誘導的ADSCs和誘導后48h、7d、14d、21d之間均有明顯統(tǒng)計學差異（P均＜0.01），至誘導14d時Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的陽性表達率均達到高峰（P均＜0.05）。4Western-blotting結(jié)果顯示，GFAP在未誘導組的ADSCs中無表達，隨誘導時間的延長其表達量增加，至7d時達到高峰（P＜0.05）。Bcl-2的表達水平隨著誘導時間的延長逐漸降低（P＜0.05）。LC3Ⅰ的表達隨誘導時間的延長，逐漸降低（P＜0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3及LC3Ⅱ的表達水平均逐漸增加，至誘導14d達到高峰（P均＜0.05）。5透射電子顯微鏡下可見到線粒體的超微結(jié)構(gòu)，凋亡小體結(jié)構(gòu)及自噬現(xiàn)象。6流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，誘導反應(yīng)過程中的細胞存活率隨著誘導時間的延長逐漸下降，早期凋亡率、晚期凋亡或壞死率隨著誘導時間的延長逐漸升高。7MTT的結(jié)果顯示，隨著誘導時間的延長，細胞的存活數(shù)量逐漸下降。 結(jié)論1ADSCs在應(yīng)用以IBMX為主要成分的誘導劑誘導分化為星形膠質(zhì)細胞的第7~14d時處于最佳的存活和分化狀態(tài)，此時可以終止反應(yīng)，并對于所得的細胞進行篩選分離和保存，以便于進行相關(guān)的應(yīng)用和研究。2在正常ADSCs中，經(jīng)線粒體信號傳導途徑產(chǎn)生的凋亡和自噬反應(yīng)較弱。3在ADSCs誘導分化為星形膠質(zhì)細胞的過程中，線粒體凋亡和細胞自噬反應(yīng)明顯增強，但自噬反應(yīng)不足以清除全部受損的線粒體，從而引發(fā)線粒體途徑介導的細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：脂肪基質(zhì)細胞 誘導分化 星形膠質(zhì)細胞 線粒體凋亡 自噬
【學位授予單位】：河北聯(lián)合大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 實驗研究13-45
• 1.1 材料與方法13-23
• 1.1.1 材料13-17
• 1.1.2 實驗方法17-23
• 1.2 結(jié)果23-37
• 1.2.1 成人 ADSCs 原代及傳代培養(yǎng)的細胞的形態(tài)學特征23-24
• 1.2.2 GFAP/Bax/Bcl-2/Cyt-c/Caspase3/LC3 的免疫細胞化學檢測結(jié)果24-30
• 1.2.3 GFAP/Bax/Bcl-2/Cyt-c/Caspase3/LC3 的 Western-blotting 結(jié)果30-32
• 1.2.4 線粒體超微結(jié)構(gòu)及凋亡與自噬的變化特征32-35
• 1.2.5 細胞生存狀態(tài)的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果35-36
• 1.2.6 細胞生長狀態(tài)的 MTT 法檢測結(jié)果36-37
• 1.3 討論37-40
• 1.4 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-45
• 第2章 綜述 自噬與線粒體自噬45-53
• 2.1 自噬的簡介及發(fā)生過程45-46
• 2.2 自噬的分子機制及其調(diào)節(jié)46-47
• 2.3 線粒體自噬47-49
• 2.3.1 線粒體的動態(tài)變化47-48
• 2.3.2 線粒體自噬的途徑48
• 2.3.3 PINK1/Parkin 介導的線粒體大自噬途徑48
• 2.3.4 Nix 介導的線粒體大自噬途徑48-49
• 2.4 線粒體自噬與疾病49-50
• 參考文獻50-53
• 致謝53-55
• 導師簡介55-56
• 作者簡介56-57
• 學位論文數(shù)據(jù)集57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 ;Ultrastructure of neuronal-like cells differentiated from adult adipose-derived stromal cells[J];Neural Regeneration Research;2010年19期

2 ;A novel ethanol-based method to induce differentiation of adipose-derived stromal cells into astrocytes[J];Neural Regeneration Research;2011年10期

3 歐亞;元小冬;蔡亞楠;陸艷卉;;ADSC源性神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞不同方向分化時的超微結(jié)構(gòu)變化研究[J];中國病理生理雜志;2011年07期

  本文關(guān)鍵詞：脂肪基質(zhì)細胞誘導分化為星形膠質(zhì)細胞過程中線粒體凋亡與自噬的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：340705