本文關(guān)鍵詞：人CD96分子胞膜外第一結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：NK細(xì)胞,即自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell)是人體固有免疫系統(tǒng)中的重要組成部分之一。當(dāng)外來病原微生物抗原侵襲時(shí),先天免疫系統(tǒng)可以作為機(jī)體的第一道天然防線,迅速活化并對(duì)病原體進(jìn)行殺傷,該殺傷作用發(fā)生在人體獲得性免疫系統(tǒng)啟動(dòng)之前,在腫瘤細(xì)胞和病毒感染的免疫反應(yīng)中起著十分重要的屏障作用。NK細(xì)胞受到表達(dá)于其表面的活化性受體和抑制性受體的共同調(diào)控。近年來,對(duì)NK細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),其識(shí)別機(jī)制十分多樣化,表達(dá)于其表面的各種受體得到了研究者的關(guān)注,尤其是一些活化性受體。 CD96(Tactile)是一個(gè)主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞,NK細(xì)胞上的免疫受體分子。它屬于免疫球蛋白超家族,胞外區(qū)有3個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(V1,V2/C和C)。CD96的配體是表達(dá)于腫瘤細(xì)胞上的CD155,最近的研究表明,CD96的第一個(gè)IgV結(jié)構(gòu)域(CD96V1)是與CD155特異性結(jié)合的主要部位,在NK細(xì)胞粘附和NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷腫瘤細(xì)胞的過程中起著重要的作用。 CD96分子的結(jié)構(gòu)尚未解析,我們通過生物信息學(xué)對(duì)CD96分子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與CD96有一定同源性的分子主要有CD226,CD86,CD113和CD166,其中CD166和CD226與CD96同源性較高。研究表明,表達(dá)于NK細(xì)胞表面的受體CD226和CD96兩者都參與免疫應(yīng)答,都屬于激活性受體,向細(xì)胞內(nèi)傳遞活化型信號(hào),從而引發(fā)多種免疫學(xué)效應(yīng)。但是目前來說,對(duì)細(xì)胞間黏附分子相互作用的機(jī)制還在探索和研究中。我們已知CD96和CD226都是免疫球蛋白超家族中的成員,其胞膜外區(qū)具有相似的空間結(jié)構(gòu),并且CD96第一個(gè)V樣結(jié)構(gòu)域和CD226的V樣結(jié)構(gòu)域同源性為29%,CD226和CD96有共同的配體CD155,CD226的結(jié)構(gòu)的解析或許能為CD96的結(jié)構(gòu)解析提供一些有價(jià)值的數(shù)據(jù)作為參考,從而為揭示CD96與CD155作用的機(jī)制奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 本研究構(gòu)建了人類CD96第一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域(hCD96V1)的表達(dá)載體,并將它在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中以包涵體形式表達(dá)。通過包涵體體外復(fù)性,我們得到了CD96可溶性蛋白。分析超速離心結(jié)果證明CD96可溶蛋白在體外以二聚體形式存在。采用座滴氣相擴(kuò)散法獲得了衍射質(zhì)量較好的CD96蛋白晶體,衍射分辨率為1.9A,晶體屬于空間群P21,晶胞參數(shù)為a=35.1,B=69.5,C=49.6A,α＝γ＝90°,β=105.4°。于此同時(shí),我們通過CD96V1四聚體染色技術(shù)驗(yàn)證了CD96第一V樣結(jié)構(gòu)域與CD155結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。并預(yù)測(cè)了CD96V1上的幾個(gè)親水性氨基酸可能與CD96二聚體的形成有關(guān)。為后續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CD96 第一IgV結(jié)構(gòu)域 細(xì)胞粘附分子 蛋白純化 結(jié)晶
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392;R3416
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 目錄6-9
• 1 文獻(xiàn)綜述9-20
• 1.1 NK細(xì)胞研究進(jìn)展概述9-15
• 1.1.1 NK細(xì)胞9
• 1.1.2 NK細(xì)胞功能和活化機(jī)制9-11
• 1.1.3 NK細(xì)胞的受體11-13
• 1.1.4 NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制13-15
• 1.2 CD96分子的研究進(jìn)展15-20
• 1.2.1 CD96的發(fā)現(xiàn),及結(jié)構(gòu)特征15-17
• 1.2.2 CD96同源性分子17-18
• 1.2.3 CD96的識(shí)別與活化機(jī)制的研究進(jìn)展18-20
• 2 引言20-21
• 3 材料和方法21-40
• 3.1 主要試劑和儀器21-26
• 3.1.1 細(xì)胞與基因21
• 3.1.2 引物21-22
• 3.1.3 載體質(zhì)粒22
• 3.1.4 儀器22-23
• 3.1.5 試劑及試劑盒23-24
• 3.1.6 溶液配制24-26
• 3.2 技術(shù)路線26-27
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法27-40
• 3.3.1 CD96V1-pET21a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建27-31
• 3.3.2 CD96V1結(jié)構(gòu)域的小量表達(dá)分析31-32
• 3.3.3 CD96V1結(jié)構(gòu)域包涵體的大量制備32
• 3.3.4 CD96V1結(jié)構(gòu)域包涵體的復(fù)性32-33
• 3.3.5 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白的純化33-34
• 3.3.6 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)晶34
• 3.3.7 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白的Sulfo-EGS交聯(lián)實(shí)驗(yàn)34
• 3.3.8 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白分析超速離心34-35
• 3.3.9 CD96V1生物素化及其突變體生物素化克隆的構(gòu)建35-37
• 3.3.10 CD96V1及其突變體生物素化和四聚體制備37-38
• 3.3.11 CD155真核表達(dá)載體構(gòu)建38
• 3.3.12 細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)CD155的細(xì)胞鑒定38-39
• 3.3.13 CD155-GFP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞39
• 3.3.14 CD96V1及其突變體的四聚體染色39-40
• 4 結(jié)果與分析40-55
• 4.1 CD96V1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建40-41
• 4.2 CD96V1結(jié)構(gòu)域的小量表達(dá)分析41-42
• 4.3 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白的純化42-44
• 4.4 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)晶的生長(zhǎng)44-45
• 4.5 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白SULFO-EGS交聯(lián)實(shí)驗(yàn)45-46
• 4.6 CD96V1結(jié)構(gòu)域蛋白分析超速離心46
• 4.7 CD96V1結(jié)構(gòu)域晶體的衍射數(shù)據(jù)收集及處理46-47
• 4.8 CD96V1結(jié)構(gòu)域及其突變體(生物素化)克隆的構(gòu)建47-50
• 4.9 CD96V1結(jié)構(gòu)域及其突變體(生物素化)四聚體蛋白的制備50-51
• 4.10 細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)CD155的細(xì)胞鑒定51-52
• 4.11 CD155真核表達(dá)載體的構(gòu)建52-53
• 4.12 CD155-GFP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞53
• 4.13 CHO細(xì)胞染色及流式細(xì)胞術(shù)鑒定53-55
• 5 討論與展望55-57
• 5.1 CD96V1結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)分析的意義55
• 5.2 CD96二聚體形成的作用力55-56
• 5.3 CD96分子的展望56-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 附錄62-65
• 縮略詞表62-64
• 載體圖譜64-65
• 致謝65-66
• 作者簡(jiǎn)介66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 William H.D.Hallett;William J.Murphy;;Natural Killer Cells:Biology and Clinical Use in Cancer Therapy[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年01期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 肖平;急性白血病亞型的免疫表型和蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究[D];暨南大學(xué);2008年

2 謝薇;骨髓增生異常綜合征發(fā)病機(jī)制的探索性研究[D];華中科技大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：人CD96分子胞膜外第一結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：340652