發(fā)布時(shí)間：2017-05-02 06:13

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)粒棘球蚴重組抗原鐵蛋白和Eg10對(duì)小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 1.觀察有保護(hù)力的細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg.ferrtin和無(wú)保護(hù)力的重組抗原Eg10刺激小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)，通過研究BMDC形態(tài)、表面分子的表達(dá)的變化以及在不同抗原刺激下產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的差別，比較Eg.ferrtin和Eg10重組抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫機(jī)制的差異。2.進(jìn)一步探索寄生蟲感染宿主的免疫基礎(chǔ)理論，為我們尋找新的治療靶點(diǎn)提供方向。 方法 1.獲取可溶形式的細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg.ferrtin和Eg10：重組表達(dá)質(zhì)粒Eg10/pET-28aBL21(DE3)plysS和Eg.ferritin/pET-28aBL21(DE3)plysS在IPTG終濃度為0.2mmol/L-1.0mmol/L，在25℃、28℃、30℃、37℃等不同條件下誘導(dǎo)表達(dá)，摸索蛋白最佳表達(dá)條件；采用GSSH復(fù)性液對(duì)包涵體蛋白復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，觀察蛋白復(fù)性情況。 2.小鼠BMDC與細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg.ferrtin和Eg10的體外共培養(yǎng)：以小鼠的骨髓細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞作為前體細(xì)胞，聯(lián)合細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4共同刺激，隔天半量換，培養(yǎng)至第8天收集細(xì)胞即為小鼠BMDC；將培養(yǎng)的BMDC分為四組，一組加入細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg.ferrtin，一組加入細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg10，兩組分別用0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml三種抗原濃度以及6h,20h,48h不同的刺激時(shí)間，選取最佳的刺激濃度和刺激時(shí)間；一組加入LPS(50ng/ul)作為陽(yáng)性對(duì)照組；一組任何物質(zhì)都不加作為空白對(duì)照組。 3.BMDC形態(tài)學(xué)的觀察：在掃描電鏡、透射電鏡下觀察各組BMDC的外部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，比較各組BMDC表面樹突的數(shù)目以及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化。 4.BMDC表型的檢測(cè)：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組BMDC的表面分子MHCⅡ、CD80、CD40、CD86的表達(dá)情況。 5.BMDC對(duì)T細(xì)胞增殖的影響：將四組小鼠BMDC分別混合同種異型T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，采用同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的方法，比較各組BMDC誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力。 6.BMDC分泌的細(xì)胞因子水平的測(cè)定：收集四組BMDC的上清，用ELISA法檢測(cè)各組BMDC分泌的IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α的水平。 結(jié)果 1.重組表達(dá)質(zhì)粒Eg10/pET-28a和Eg.ferritin/pET-28a在IPTG終濃度為0.2mmol/L-1.0mmol/L，在25℃、28℃、30℃、37℃等不同條件下誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg.ferrtin和Eg10仍以包涵體的形式存在，采用GSSH復(fù)性液對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性，獲得可觀的可溶形式的細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg.ferrtin和Eg10。 2.建立小鼠BMDC體外培養(yǎng)的方法。每?jī)芍恍∈蟮墓撬杓?xì)胞可以擴(kuò)增約1-2x107個(gè)樹突狀細(xì)胞，BMDC純度達(dá)到70%以上。 3. Eg.ferrtin體外刺激BMDC能使其成熟，且上調(diào)BMDC表面MHC一Ⅱ類分子和共刺激分子的表達(dá)量，具有典型的成熟樹突狀細(xì)胞的形態(tài)，可誘導(dǎo)T細(xì)胞大量增殖；BMDC高表達(dá)IL-12、TNF-α等Th1型細(xì)胞因子，與空白對(duì)照組比，差異顯著(P0.01)。 4. Eg10體外刺激BMDC不能使其成熟，，且中等程度表達(dá)MHC一Ⅱ類分子，下調(diào)共刺激分子表達(dá)量，誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖能力與對(duì)照組相比無(wú)差異。BMDC分泌的IL-6較高，與空白對(duì)照組比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，IL-10的表達(dá)量與空白對(duì)照組比明顯升高。(P0.01)。 結(jié)論 1. Eg.ferrtin重組抗原能誘導(dǎo)BMDC成熟，刺激T細(xì)胞的增殖和分化，經(jīng)Eg.ferrtin刺激的BMDC高表達(dá)IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子，推測(cè)有可能產(chǎn)生Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，從而通過對(duì)病原體進(jìn)行原始?xì)_(dá)到清除入侵的病原體而保護(hù)機(jī)體的作用。 2. Eg10重組抗原不能誘導(dǎo)BMDC成熟，刺激T細(xì)胞的增殖的能力較弱，經(jīng)Eg10刺激的BMDC表達(dá)的IL-6、IL-10等細(xì)胞因子的量較高，推測(cè)有可能產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答，引發(fā)免疫抑制的作用，從而有利于病原體的存活。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)粒棘球蚴 樹突狀細(xì)胞 rEg.ferrtin rEg10 免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 中英文縮寫詞對(duì)照表11-13
• 目錄13-14
• 前言14-20
• 技術(shù)路線20-21
• （一）重組融合表達(dá)質(zhì)粒 Eg.ferrtin/pET-28a 和 Eg10/pET-28a 的表達(dá)、純化21-31
• 材料21-22
• 方法22-26
• 結(jié)果26-31
• （二）細(xì)粒棘球蚴重組抗原體外刺激小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞的形態(tài)，表型和功能變化31-46
• 材料和方法31-37
• 結(jié)果37-46
• 討論46-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 致謝64-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66

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本文編號(hào)：340429