目的:證明血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹的一種重要的高分子量過敏原。方法:采用裂解液法提取蟹總蛋白,通過SDS-PAGE、二維電泳及Western blot分析蟹中過敏原組分并進(jìn)行比對(duì),再通過質(zhì)譜分析鑒定未知過敏原。以臨床中華絨螯蟹過敏患者的血清作為識(shí)別抗體,通過斑點(diǎn)免疫印記實(shí)驗(yàn)證明疑似蛋白的致敏特性。結(jié)果:通過SDS-PAGE及二維電泳分析,證明本實(shí)驗(yàn)所提取的蟹總蛋白組分完全。Western blot結(jié)果顯示,中華絨螯蟹至少有18種與陽(yáng)性血清反應(yīng)的組分,其中,70⁸0k D處兩個(gè)蛋白處于同一等電點(diǎn),可能為同一蛋白,且反應(yīng)斑點(diǎn)清晰;質(zhì)譜分析結(jié)果顯示疑似蛋白為血藍(lán)蛋白;斑點(diǎn)免疫印記結(jié)果顯示血藍(lán)蛋白與患者血清的反應(yīng)頻率為61%。結(jié)論:血藍(lán)蛋白為中華絨鰲蟹中一種重要的高分子量過敏原。 

【文章來源】：中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2015,31(10)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

蟹總蛋白粗提液中蛋白組分分析結(jié)果

狀痔嵋?的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，至少有18條明顯的蛋白條帶。其中，20、34、40kD處分別為已知的肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶。在70～90kD之間有四條明顯的條帶，但該分子量范圍內(nèi)的蛋白尚未見相關(guān)報(bào)道。二維電泳分析結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果一致，大部分蛋白組分的等電點(diǎn)在4～9之間，其中，25～45kD之間的蛋白著色最深，含量最豐富，應(yīng)多為已報(bào)道的原肌球蛋白及精氨酸激酶。在等電點(diǎn)5.2、70～80kD處可分辨兩個(gè)明顯的點(diǎn)。結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果相符。2.2蟹中過敏組分分析蟹總蛋白提取液經(jīng)一維印記分析，結(jié)果如圖2A所示，中華絨螯蟹過敏原中，除34kD原肌球蛋白、40kD精氨酸激酶外，55kD以上的高分子量蛋白占有很大比例，且70～80kD處反應(yīng)條帶較深。利用二維印記，使用混合陽(yáng)性圖1蟹總蛋白粗提液中蛋白組分分析結(jié)果Fig．1AnalysisofcomponentsofextractofEriocheirsinensisproteinsNote:A.SDS-PAGEanalysis.M.Marker;1.Hemocyanin;2.ExtractofEriocheirsinensisproteins;B.Two-dimensionalelectrophoresisa-nalysis.M.Marker;1and2.Suspectedproteins.血清作為探針進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖2B所示，25～45kD處出現(xiàn)多個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)，與已報(bào)道的研究結(jié)果相符。同時(shí)，70～80kD處出現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)，證明該處蛋白是中華絨螯蟹中的過敏原。2.3質(zhì)譜分析結(jié)果對(duì)二維電泳70～90kD處兩個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，肽指紋圖譜及質(zhì)譜結(jié)果如圖3、表1所示，其中，圖3A為疑似蛋白1，普庫(kù)索取號(hào)為gi|334145788，預(yù)測(cè)分子量為78390，等電點(diǎn)約為5.21，Mascot得分為107，有16個(gè)肽段可與中華絨螯蟹血藍(lán)蛋白匹配;圖3B為疑似蛋白2，圖2蟹總蛋白粗提液中過敏原組分分析結(jié)果Fig．2AnalysisofallergensofextractofEriocheirsinensisproteinsNote:A.Wester

櫸址治黿峁?Fig．1AnalysisofcomponentsofextractofEriocheirsinensisproteinsNote:A.SDS-PAGEanalysis.M.Marker;1.Hemocyanin;2.ExtractofEriocheirsinensisproteins;B.Two-dimensionalelectrophoresisa-nalysis.M.Marker;1and2.Suspectedproteins.血清作為探針進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖2B所示，25～45kD處出現(xiàn)多個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)，與已報(bào)道的研究結(jié)果相符。同時(shí)，70～80kD處出現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)，證明該處蛋白是中華絨螯蟹中的過敏原。2.3質(zhì)譜分析結(jié)果對(duì)二維電泳70～90kD處兩個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，肽指紋圖譜及質(zhì)譜結(jié)果如圖3、表1所示，其中，圖3A為疑似蛋白1，普庫(kù)索取號(hào)為gi|334145788，預(yù)測(cè)分子量為78390，等電點(diǎn)約為5.21，Mascot得分為107，有16個(gè)肽段可與中華絨螯蟹血藍(lán)蛋白匹配;圖3B為疑似蛋白2，圖2蟹總蛋白粗提液中過敏原組分分析結(jié)果Fig．2AnalysisofallergensofextractofEriocheirsinensisproteinsNote:A.Western-blotanalysisofextractofEriocheirsinensisproteins．M.Marker;1－6.Serafrom6crab-allergicsubjects;N.Negativeserum;B.Two-dimensionalWesternblotanalysisofextractofEri-ocheirsinensisproteins.1.Suspectedproteins.圖3疑似蛋白肽指紋圖譜Fig．3PeptideMassFingerPrintofsuspectedproteinsNote:A.PeptideMassFingerPrintofsuspectedprotein1;B.PeptideMassFingerPrintofsuspectedprotein2.ObservedMr(expt)Mr(calc)DeltaStartEndMissIonsPeptide.張盈瑩等血藍(lán)蛋白是中華絨鰲蟹重要的高分子量過敏原第10期·1377·

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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