發(fā)布時間：2017-05-01 15:11

  本文關(guān)鍵詞：分枝桿菌RskA蛋白不同表達水平的生理效應分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前全球人群結(jié)核分枝桿菌感染嚴重,約有20億人(世界人口的三分之一)已經(jīng)感染了結(jié)核分枝桿菌。雖然國際社會一直給予極大的關(guān)注,各國政府也一直致力于結(jié)核病防治工作,結(jié)核病仍然嚴重危害著人們的健康。特別是近年來耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)和HIV共感染更使得結(jié)核防治工作變得任重道遠。 對于流行疾病的控制,有效的早期診斷和早期治療無疑是整個防治環(huán)節(jié)中的首選切入點。鑒于此,開發(fā)新的抗結(jié)核的藥物和疫苗,顯得尤為迫切。但目前,對于結(jié)核桿菌致病、耐藥和潛伏的機制尚不明了。對相關(guān)機制的探究,將會幫助我們更好的了解結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌,也將為藥物和疫苗的研發(fā)打下堅實基礎(chǔ)。 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在著大量可以被CD8+T細胞所識別的蛋白抗原。MPB70和MPB83就是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中的主要分泌蛋白,也是一類保護性抗原。而MPB70和MPB83抗原蛋白的表達受到sigK(Rv0445c)的調(diào)節(jié)作用。與其臨近的Rv0444C基因編碼anti-sigK因子RskA,可以抑制SigK的功能。同時,我們在做前期臨床菌株分型的過程中,注意到部分臨床菌株中Rv0444c(242位)發(fā)生了單堿基突變(G→C),導致其編碼的81位密碼子由谷氨酸突變?yōu)樘於彼岬腻e義突變。這一突變導致了anti-SigK因子失活,從而解除了對SigK的抑制,最后導致了抗原蛋白MPB70和MPB83發(fā)生表達變化。 而MPB70和MPB83又是一組與細菌毒力有關(guān)聯(lián)性的抗原蛋白。因此我們希望通過此次實驗,嘗試揭示不同RskA表達情況,以及242位錯義突變對菌株毒力和胞內(nèi)存活能力的影響,為更進一步研究結(jié)核分枝桿菌毒力、探究結(jié)核病發(fā)病機制做一些鋪墊。 本實驗構(gòu)建了RskA高表達菌株(RskA-High)、RskA低表達株(RskA-Low)、突變株(RskA-Mut),以及pMV261、pACT空質(zhì)粒重組對照菌株,觀察發(fā)現(xiàn)不同RskA蛋白表達水平對菌體、菌落形態(tài)無明顯影響。而不同條件環(huán)境下胞外群體生長情況差異,和不同菌株胞內(nèi)生長情況的差異顯示,RskA-High菌株在胞內(nèi)/低氧環(huán)境中表現(xiàn)出更好的適應性。RskA-Low菌株則表現(xiàn)出對胞內(nèi)/低氧環(huán)境的不耐受。 而RskA不同表達水平的各菌株攻擊THP1細胞后,刺激誘導TNF-α水平的差異證實,RskA-High菌株刺激THP1細胞分泌TNF-α量更少,初步佐證了RskA-High菌株RskA蛋白高表達后抑制SigK因子,并負向調(diào)控毒力相關(guān)蛋白MPB70、MPB83。而菌株毒力的下降,使得菌株刺激細胞因子分泌的能力下降,從而更容易在胞內(nèi)實現(xiàn)免疫逃逸,顯示出較為良好的適存能力。 為進一步獲得佐證,基于RskA低表達菌株在胞內(nèi)無法正常生長,我們選擇了RskA-High、RskA-Mut和pMV261空質(zhì)粒對照菌株,采取尾靜脈注射的方式攻擊C57BL/6小鼠,同時設置PBS組等量注射作為對照。7d、14d、21d、28d分批處死小鼠,觀察活力情況變化、臟器和尾部表觀變化,并對肺脾組織進行固定制片,通過HE染色進行病理檢測分析。小鼠臟器超微結(jié)構(gòu)的變化差異,顯示出RskA-High菌株對小鼠臟器造成的損害較輕,提示RskA-High菌株毒力相對較弱,也進一步證實了RskA對于結(jié)核分枝桿菌MPB70和MPB83兩種蛋白表達情況的負調(diào)控。 綜上所述,我們對RskA/SigK調(diào)節(jié)毒力相關(guān)蛋白進行了實驗驗證,通過胞內(nèi)外細菌的培養(yǎng)情況,確認了RskA高表達菌株表現(xiàn)出更強的胞內(nèi)生存能力。菌株攻擊細胞后相關(guān)細胞因子的檢測和小鼠的病理檢測結(jié)果也顯示,這一適應性是RskA高表達菌株通過負調(diào)控毒力相關(guān)蛋白,使得菌株減毒,減弱細胞免疫應答來達成的。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核病 RskA/SigK調(diào)控 MPB70/83蛋白 菌株毒力 病理檢測
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 第一章 文獻綜述7-15
• 第一節(jié) 結(jié)核病與結(jié)核病現(xiàn)狀概況7-10
• 第二節(jié) 海分枝桿菌——研究結(jié)核的良好模型10-11
• 第三節(jié) 結(jié)核分枝桿菌中的sigma因子家族11-15
• 第二章 實驗試劑和材料15-43
• 第一節(jié) 實驗材料15-22
• 第二節(jié) 實驗方法22-43
• 第三章 實驗結(jié)果43-61
• 第四章 實驗結(jié)果分析討論與展望61-68
• 第一節(jié) 結(jié)果分析與討論61-65
• 第二節(jié) 小結(jié)與后續(xù)展望65-68
• 參考文獻68-75
• 碩士期間的科研成果75-76
• 致謝76-78

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1 鐘江;;病原體毒力的進化[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);2003年05期

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本文編號：339157