發(fā)布時(shí)間：2021-09-07 15:03

　　研究背景：作為一種高效的基因調(diào)控手段，RNA干擾具有靶點(diǎn)專(zhuān)一、用量小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因治療等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的短發(fā)夾RNA載體雖然解決了常規(guī)小RNA短時(shí)效的缺點(diǎn)，但卻伴隨嚴(yán)重的細(xì)胞毒作用。基于內(nèi)源microRNA的新一代人工microRNA載體（amiRNA）可以很好解決載體安全性問(wèn)題，表達(dá)效率卻不盡如人意。如何提高amiRNA載體的表達(dá)效率是目前小RNA載體急需解決的問(wèn)題，amiRNA載體的優(yōu)化工作對(duì)推動(dòng)RNA干擾研究及其基因藥物的發(fā)展意義重大。研究目的：本論文的主要目的是解決目前amiRNA載體表達(dá)中存在的瓶頸問(wèn)題，獲得高表達(dá)效率的新型amiRNA載體，加速小RNA基因藥物的臨床應(yīng)用。研究方法：（1）利用Block-iT RNAi Designer軟件設(shè)計(jì)靶向人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的amiRNA序列；（2）通過(guò)熒光定量、Western-Blot、Telochaser、細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、血管生成、移植瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)分析amiRNA的沉默效應(yīng)和抗腫瘤活性；（3）借助報(bào)告基因沉默實(shí)驗(yàn)和基因芯片技術(shù)分析amiRNA的特異性和安全性；（4）依據(jù)miRNA引導(dǎo)序列的長(zhǎng)度、指紋圖譜、自由能等特征值差... 

【文章來(lái)源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：123 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

RNAi通路簡(jiǎn)圖

在胞內(nèi)的內(nèi)源性表達(dá)[42]。之后不久，Chung 等人發(fā)現(xiàn)以鼠 miR-155 原始轉(zhuǎn)錄本（pri-mmu-miR-155）為小 RNA 表達(dá)框的小 RNA 表達(dá)載體同樣可以實(shí)現(xiàn)目的小RNA 的長(zhǎng)效、安全、可控的表達(dá)[43]。鑒于這兩種載體在安全性和可控性方面優(yōu)于第一代小 RNA 表達(dá)載體，人們將以?xún)?nèi)源 miRNA 原始轉(zhuǎn)錄本為小 RNA 表達(dá)框的小 RNA 表達(dá)載體稱(chēng)為 amiRNA 載體，又稱(chēng)為第二代小 RNA 表達(dá)載體。以 pri-hsa-miR-30a 和 pri-mmu-miR-155 為小 RNA 表達(dá)框的 amiRNA 載體是目前已被廣泛認(rèn)可且商品化的兩種 amiRNA 載體，雖然在安全性上實(shí)現(xiàn)了對(duì)第一代小 RNA 表達(dá)載體的突破，但對(duì)目的 siRNA 的表達(dá)卻不夠高效[5-7]。后續(xù)也有學(xué)者嘗試進(jìn)行以其它內(nèi)源 miRNA 原始轉(zhuǎn)錄本為小 RNA 表達(dá)框的 amiRNA 載體研究，但其表達(dá)效率未能實(shí)現(xiàn)對(duì)這兩種商品化 amiRNA 載體的超越[7, 44-48]。由于表達(dá)不夠高效，人們不得不通過(guò)加大劑量來(lái)彌補(bǔ)自身表達(dá)的不足，這必然導(dǎo)致高劑量帶來(lái)的潛在副作用和成本問(wèn)題[49]。研究表明，現(xiàn)有 amiRNA 載體表達(dá)不高效的主要原因是 amiRNA 載體中所采用的表達(dá)框不能高效地加工出目的小 RNA[8]。

1.2.2 腺相關(guān)病毒RNAi 載體化表達(dá)中形成的 shRNA 載體或 amiRNA 載體同樣需要借助一定的投遞介質(zhì)才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，常用的介質(zhì)有化學(xué)型介質(zhì)和病毒型介質(zhì)兩種。病毒型載體具有轉(zhuǎn)染效率高、宿主范圍廣、時(shí)效長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是小 RNA 載體化表達(dá)和基因治療的主流運(yùn)載工具，占基因治療臨床試驗(yàn)的 72.4-82.0%（圖 1.3）。目前已經(jīng)很多基因藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但卻只有一個(gè)獲得批準(zhǔn)，其原因除了跟選擇的基因有關(guān)外，跟使用的載體也密切相關(guān)。載體本身的安全性也是阻礙其成功上市的重要原因，如腺病毒的自主復(fù)制能力、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因整合能力等都會(huì)給基因治療帶來(lái)潛在的威脅。而其中的腺相關(guān)病毒（Adenoassociated virus,AAV）由于具有良好的安全性，日益受到人們的重視。第一個(gè)基因藥物 Glybera的誕生除了其治療基因的有效性外，還有一個(gè)重要原因就是其所使用 AAV 這個(gè)基 因 載 體 的 安 全 性 。（http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/002145/smops/Positive/human_smop_000235.jsp&mid=WC0b01ac058001d127）。


本文編號(hào)：3389756