本文關(guān)鍵詞：胞外HSP60上調(diào)心肌TLR2和TLR4受體表達(dá)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Toll樣受體（toll-like receptors, TLRs）是免疫細(xì)胞識別病原體分子的一類重要受體，也在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元等多種細(xì)胞表達(dá)，參與細(xì)胞應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等生理病理過程。已被克隆的人類TLRs有11種亞型，被報道在鼠類心肌細(xì)胞表達(dá)的包括TLR2/3/4/5/7/9亞型。HSP60(heat shock protein60)是HSPs家族的成員之一，生理狀態(tài)下主要位于線粒體內(nèi)（約70-80%），小部分位于胞漿。文獻(xiàn)報道，外源性HSP60（胞外HSP60）能夠激活巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的TLR2和TLR4受體，導(dǎo)致腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素（interleukin，IL）等致炎因子產(chǎn)生，但胞外HSP60是否影響TLR2和TLR4受體表達(dá)未見報道。我們前期報道，在心肌缺血大鼠模型，HSP60異常出現(xiàn)在血清中，即出現(xiàn)胞外HSP60（Lin et al,AJP,2007;293: H2238-47）。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞系，外源性HSP60能夠上調(diào)TLR2和TLR4表達(dá)，而缺血心肌TLR2和TLR4表達(dá)也上調(diào)。因此，我們推測，心肌缺血時，異常出現(xiàn)在血液中的HSP60（胞外HSP60）很可能不僅作為配體激活心肌細(xì)胞的TLR2和/或TLR4，而且能夠上調(diào)心肌表達(dá)TLR2和TLR4。為證明這一假設(shè)，本課題在正常培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞，研究了外源性HSP60上調(diào)TLR2/4表達(dá)的作用及信號機(jī)制；并且，在H9c2心肌細(xì)胞模擬缺血模型和整體大鼠心肌缺血模型，研究了內(nèi)源性胞外HSP60上調(diào)TLR2/4表達(dá)的作用及信號機(jī)制。 研究方法 在大鼠H9c2心肌細(xì)胞模型中，給予外源性HSP60或模擬缺血（無血清+低糖+1%低氧），ELISA法檢測培液上清HSP60含量檢測模擬缺血是否引起HSP60出胞；通過real-time PCR和Western blot法檢測TLR2/4表達(dá)；通過特異性阻斷HSP60信號通路中的主要信號分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF-κB”，研究HSP60上調(diào)TLR2/4表達(dá)的信號機(jī)制。 在整體大鼠心肌缺血模型中，結(jié)扎冠狀動脈左前降支（LAD）造成心肌缺血以及靜脈注射HSP60抗體來中和封閉血漿中的HSP60后，通過real-time PCR和Western blot法檢測心肌TLR2/4表達(dá)；ELISA法和Western blot法檢測血漿HSP60。 研究結(jié)果 1.在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞系，外源性HSP60通過TLR4-MyD88-JNK/NFκB信號通路介導(dǎo)上調(diào)TLR2和TLR4表達(dá)：外源性HSP601μg/mL使得TLR2和TLR4mRNA水平和蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)；特異性阻斷HSP60信號通路中的主要信號分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF-κB”結(jié)果表明，TLR4siRNA、MyD88抑制性多肽（Inhi MyD88）、JNK抑制劑SP600125、NF-κB抑制劑PDTC四種干預(yù)能夠顯著抑制外源性HSP60引起的TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)，而TLR2siRNA和p38抑制劑SB203580無顯著效應(yīng)，表明HSP60上調(diào)TLR2/4表達(dá)的效應(yīng)由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介導(dǎo)。TLR4siRNA不僅抑制TLR4表達(dá)，而且顯著抑制HSP60引起的TLR2/4上調(diào)，TLR2siRNA僅僅抑制TLR2表達(dá)，不影響HSP60引起的TLR2/4上調(diào)。 2.在模擬缺血培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞，HSP60出現(xiàn)在胞外，并且經(jīng)TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路參與介導(dǎo)模擬缺血所致TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)：在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞，模擬缺血引起培液上清中出現(xiàn)HSP60，即HSP60出現(xiàn)在胞外；同時，模擬缺血引起TLR2/4表達(dá)上調(diào)，用抗體特異性封閉胞外HSP60或者阻斷信號分子TLR4、 MyD88、 JNK和NF-κB能夠顯著抑制該效應(yīng)，表明“胞外HSP60-TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路”參與介導(dǎo)模擬缺血所致TLR2/4表達(dá)上調(diào)。 3.在整體大鼠心肌缺血模型，HSP60異常出現(xiàn)在血漿中，并且參與介導(dǎo)缺血所致心肌TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)：在冠狀動脈左前降支（LAD）結(jié)扎所致大鼠急性心肌缺血模型，我們用Western blot和ELISA法均檢測到LAD結(jié)扎4h后血清中出現(xiàn)HSP60，而假手術(shù)組（sham）基本檢測不到，表明心肌缺血引起HSP60異常出現(xiàn)在胞外； LAD結(jié)扎后4h，Western blot法檢測到左室前壁、左室后壁、右室以及室間隔中TLR2和TLR4受體表達(dá)水平均顯著高于假手術(shù)組（sham），表明LAD結(jié)扎后，全心臟TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)；用HSP60抗體中和血清中的HSP60，觀察到能夠顯著抑制心肌缺血引起的TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)，而對照抗體IgG沒有抑制效應(yīng)，表明胞外HSP60參與介導(dǎo)心肌缺血所致TLR2/4表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論 1.在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞系，外源性HSP60上調(diào)TLR2和TLR4表達(dá)，該效應(yīng)由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介導(dǎo)。 2.在模擬缺血培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞， HSP60出現(xiàn)在胞外，并且經(jīng)TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路參與介導(dǎo)模擬缺血所致TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)。 3.在整體大鼠心肌缺血模型，HSP60異常出現(xiàn)在血漿中，并且參與介導(dǎo)缺血所致心肌TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)。 上述研究表明，心肌缺血時HSP60異常出現(xiàn)在胞外，，胞外HSP60通過TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路使得心肌細(xì)胞TLR2/4表達(dá)上調(diào)，該作用是缺血心肌TLR2/4表達(dá)上調(diào)的機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：TLR-2/4 HSP60 心肌缺血 TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 英文縮寫及英漢全稱10-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 2.1.1 細(xì)胞15
• 2.1.2 動物15
• 2.1.3 主要試劑15-17
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 2.3 主要溶液配制18-22
• 2.4 大鼠 H9c2 心肌細(xì)胞系的培養(yǎng)模型22-24
• 2.5 大鼠心肌缺血模型24
• 2.6 實(shí)時熒光定量 RT-PCR 方法24-30
• 2.7 ELISA 法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液中以及動物血清中 HSP60 含量30-31
• 2.8 Western blot 法檢測 TLR2、TLR4、MyD88、Trif 蛋白的表達(dá)31-34
• 2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計34-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-50
• 討論50-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 綜述55-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 致謝66-67
• 在讀期間發(fā)表論文67

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本文編號：338841