發(fā)布時(shí)間：2017-05-01 08:09

  本文關(guān)鍵詞：基于細(xì)胞穿透肽的Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的改造，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1988年,美國的Green Loewenstein和Frankel Pabo首次報(bào)道并證實(shí)了I型人免疫缺陷病毒反式轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Human immunod eficiency virus transactivaloroftronscription, HIV-1) Tat多肽能單獨(dú)穿過多種細(xì)胞的細(xì)胞膜,從此揭開了對細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptides, CPP)研究的序幕；1994年,FaweH等報(bào)道Tat能介導(dǎo)外源性蛋白進(jìn)入細(xì)胞,并確定了其蛋白內(nèi)化的Tat蛋白的最短序列是包含了11個(gè)氨基酸的47-57位氨基酸序列,該序列被稱為"Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)”(peptide transduction domain, PTD),此發(fā)現(xiàn)譽(yù)為是CPPs發(fā)展史的一個(gè)重要里程碑；1997年,Heitz和Divita課題組設(shè)計(jì)了第一個(gè)CPP,能以非共價(jià)結(jié)合的方式輸送核酸進(jìn)入細(xì)胞,從此開啟了人工設(shè)計(jì)合成CPP的大門；CPPs領(lǐng)域的另一個(gè)重大突破是Dowdy課題組首次進(jìn)行了CPP體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn),他們利用Tat47-57與大分子蛋白β-半乳糖苷酶(p-galactosidase,P-Gal)連接,腹腔注射到小鼠體內(nèi),觀察組織切片染色結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Tat47-57可攜帶β-Gal進(jìn)入包括腦在內(nèi)的體內(nèi)多個(gè)組織器官,從此CPPs的研究由體外迅速擴(kuò)展至體內(nèi)。于此同時(shí)越來越多的CPPs被研究人員發(fā)現(xiàn),如果蠅的轉(zhuǎn)錄因子Antennapedia (Antp)、皰疹病毒的VP22蛋白人周期蛋(human period 1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Syn B1、纖維母細(xì)胞生長因子FGF-4、融合蛋白gp41、外毒素A、g分泌酶和朊病毒等大量自然界的蛋白質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)了具有穿膜效應(yīng)的多肽序列�，F(xiàn)已明確,CPPs是一類能攜帶外源物質(zhì)的多肽,氨基酸長度常少于30,常又被稱為膜穿透肽(membrane penetrating peptide, MPP)、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(proteintransduction domain, PTD)或膜轉(zhuǎn)位序列(membrane translocation sequence)。它不僅可以穿透細(xì)胞膜,還可以作為載體將不同種類的外源物質(zhì)導(dǎo)入種類廣泛的細(xì)胞中。根據(jù)細(xì)胞穿透肽的來源,我們可以將其分為天然蛋白來源的天然肽、天然蛋白來源的嵌合肽和人工設(shè)計(jì)的合成肽。如下表：至今在體內(nèi)由CPP介導(dǎo)的外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)已超過了300種。外源物質(zhì)主要分為三類：蛋白質(zhì)、核酸和少量小分子其它物質(zhì)。其中蛋白質(zhì)類外源性物質(zhì)包括酶類、細(xì)胞凋亡因子、蛋白質(zhì)類激素、分子伴侶以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等功能蛋白質(zhì),如超氧化物歧化酶、細(xì)胞凋亡調(diào)控因子p53、神經(jīng)營養(yǎng)因子、熱激蛋白27和Rho蛋白等。核酸類外源性物質(zhì)包括質(zhì)粒、雙鏈DNA、反義寡核苷酸和干擾小RNA(small interfering RNA, siRNA)等；其它物質(zhì)有染料(醫(yī)學(xué)影像)、200 nm的脂質(zhì)體、噬菌體和超順磁性粒子等。相對于其他運(yùn)輸?shù)妮d體,CPPs具有操作簡單,作用迅速,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高,相對安全,對細(xì)胞損害相對較小等優(yōu)點(diǎn)。因此,近年來CPPs受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注,研究主要集中在應(yīng)用與穿膜的機(jī)制兩個(gè)方面。于此同時(shí)目前CPP向體內(nèi)和體外輸送物質(zhì)的方法逐漸變得成熟。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,已成為研究細(xì)胞內(nèi)分子相互作用的有用工具；在應(yīng)用方面,CPP連接的一些藥物已進(jìn)入臨床前、臨床I和II期試驗(yàn),尤其在腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病的治療中顯示出明顯優(yōu)勢�；诩�(xì)胞穿透肽的種種特性和優(yōu)點(diǎn),CPPs將在藥學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷治療、基礎(chǔ)研究領(lǐng)域顯示越來越重要的地位。細(xì)胞穿透肽作為載體搭載貨物分子入胞是一個(gè)復(fù)雜的過程,盡管各種CPP功能相似,但結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和入胞機(jī)制不盡相同。目前研究人員的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為,CPPs穿透細(xì)胞主要存在3條比較合理的入胞機(jī)制：內(nèi)吞、直接穿膜與依靠特定跨膜結(jié)構(gòu)。一個(gè)CPP分子的入胞的具體機(jī)制是有賴于多個(gè)與之相關(guān)的參數(shù),如分子大小(攜帶物質(zhì))、溫度、細(xì)胞類型和細(xì)胞內(nèi)外的環(huán)境等因素。比如富含Arg的短CPP,主要通過內(nèi)吞方式進(jìn)行細(xì)胞攝取。Tunnemann等曾報(bào)道了Tat肽與小肽貨物融合后進(jìn)入細(xì)胞是通過一種快速的、非內(nèi)吞依賴直接入膜的過程,而與大的貨物融合后則是通過內(nèi)吞途徑內(nèi)化入胞；Duchardt教授等最近報(bào)道了當(dāng)Antp的濃度40μmol/L時(shí)其內(nèi)化機(jī)制則可能涉及包括依靠特定跨膜結(jié)構(gòu)在內(nèi)的多種入胞通路�；蚯贸�(gene knockout)是指一種遺傳工程技術(shù),是研究相關(guān)基因功能最常用的實(shí)驗(yàn)方法。其原理是針對某個(gè)序列已知但功能未知的序列,通過構(gòu)建相關(guān)基因的缺失突變體,改變生物的遺傳基因,令特定的基因功能喪失作用,從而使部分功能被屏障,并可進(jìn)一步對生物體造成影響,進(jìn)而推測出該基因的生物學(xué)功能。目前實(shí)現(xiàn)基因敲除的常用技術(shù)有Cre-LoxP系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等,Cre-LoxP系統(tǒng)屬于位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng),是近年來最普遍應(yīng)用的一種條件性敲除基因的方法,來源于噬菌體P1,包含有兩個(gè)重要的組成部分：一個(gè)是LoxP位點(diǎn)；另一個(gè)是識別LoxP位點(diǎn)的Cre重組酶。這一系統(tǒng)主要通過位點(diǎn)特異性的Cre重組酶識別34 bp的部分反轉(zhuǎn)重復(fù)的LoxP序列(ATAACTTCGTATAAT GTATGCTATACGAAGTTAT),通過分子內(nèi)重組將方向相同的2個(gè)LoxP位點(diǎn)問的序列刪除。該系統(tǒng)1981年被首次發(fā)現(xiàn),自1993年被Gu等研究人員正式作為一種基因操作手段應(yīng)用以來,己廣泛地應(yīng)用于基因克隆、人工抗體文庫的構(gòu)建、抗體重排和類型轉(zhuǎn)換等動物模型和嵌合基因組等研究領(lǐng)域并體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢,并且該系統(tǒng)已經(jīng)成功用于多種真核細(xì)胞和細(xì)菌如谷氨酸棒狀桿菌、炭疽桿菌、植物乳桿菌的基因敲除。Cre-LoxP系統(tǒng)可促進(jìn)對未知基因功能的研究。利用脂質(zhì)體的方式外源結(jié)合Cre重組酶轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉默特定基因近年來已經(jīng)有相關(guān)的報(bào)道,但是該方式存在著操作復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、沉默效果不明顯的缺點(diǎn),同時(shí)難以實(shí)現(xiàn)在體水平的基因敲除以及組織靶向敲除的目的。而CPPs不僅具有穿膜快速、直接、細(xì)胞毒副作用小和作用顯著等優(yōu)點(diǎn),還能實(shí)現(xiàn)搭載貨物分子的體內(nèi)運(yùn)輸,并且能夠通過修飾獲得靶向定位能力。核定位序列(Nuclear localization signal, NLS)是蛋白質(zhì)的一個(gè)結(jié)構(gòu)域,為另一形式的信號肽。通常為4-8個(gè)氨基酸,它能與入核載體相互作用,使蛋白能被運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核。第一個(gè)被確定的NLS序列的蛋白質(zhì)是SV40 (Simian vacuolating virus 40)的T抗原(92kDa),也是研究的最成熟的核定位信號。NLS的特點(diǎn)：(1)核心NLS由含4個(gè)賴氨酸或者精氨酸的六肽構(gòu)成；(2)不含酸性氨基酸和大分子的氨基酸；(3)核心NLS的旁側(cè)為脯氨酸或甘氨酸；(4)旁側(cè)順序中部存在疏水氨基酸以保證NLS位于蛋白質(zhì)的分子表面。借助這一特殊的信號肽,可以提高CPPs向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)Cre重組酶的效率。本研究旨在對實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的152條CPPs多肽基礎(chǔ)上,進(jìn)行進(jìn)一步的研究：(1)比較上述多肽內(nèi)化MEF細(xì)胞的效率,篩選對MEF細(xì)胞內(nèi)化能力較高的多肽；(2)利用熒光強(qiáng)度定量比較,建立起內(nèi)化多肽能力的評價(jià)方法；(3)選擇內(nèi)化MEF細(xì)胞能力較高的多肽,與連接重組酶Cre以及NLS構(gòu)建原核融合蛋白表達(dá)載體；(4)利用融合蛋白His-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP內(nèi)化Cdc42基因兩端帶有LoxP位點(diǎn)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,蛋白水平去評價(jià)該系統(tǒng)敲除目的基因的效果�；谝陨涎芯勘尘�,在具體的研究工作中我采用如下的研究方法如通過克隆質(zhì)粒構(gòu)建、原核表達(dá)純化融合蛋白、EGFP進(jìn)行示蹤、熒光強(qiáng)度比較效率；利用含綠色熒光蛋白標(biāo)簽的辦法純化蛋白二次篩選驗(yàn)證多肽內(nèi)化強(qiáng)度；利用M5對選取的5個(gè)代表性多肽進(jìn)行內(nèi)化效率的比較；利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行多肽理化性質(zhì)與內(nèi)化關(guān)聯(lián)的分析；Cdc42基因兩端帶LoxP位點(diǎn)的C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離使用外源添加PBS作刺激物的方法誘導(dǎo)分離得到Cdc42基因兩端帶LoxP位點(diǎn)的C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；利用蛋白免疫印跡方法在蛋白水平檢測基因敲除效果。通過以上實(shí)驗(yàn)研究,我們得到以下結(jié)果：(1)從實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的152條CPPs多肽基礎(chǔ)上,得到強(qiáng)內(nèi)化多肽17條,弱內(nèi)化多肽12條,幾乎不內(nèi)化的多肽123條；(2)通過熒光強(qiáng)度定量的方法完成了驗(yàn)證后的五個(gè)強(qiáng)內(nèi)化多肽內(nèi)化MEF細(xì)胞內(nèi)化效率的比較；(3)通過對強(qiáng)內(nèi)化多肽的電荷數(shù)、分子量、親水疏水性質(zhì)和氨基酸的種類多角度分析發(fā)現(xiàn)：內(nèi)化后特征為顆粒狀的不論是強(qiáng)內(nèi)化多肽還是弱內(nèi)化多肽凈電荷全部為正電荷或零電荷；強(qiáng)內(nèi)化多肽親水系數(shù)為-2.286-2.7,強(qiáng)內(nèi)化較多肽等電點(diǎn)分布3.49-12.00；強(qiáng)內(nèi)化多肽普遍多含堿性氨基酸,且性質(zhì)偏親水性；(4)成功構(gòu)建以下重組質(zhì)粒載體：pET14b-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP、pET14b-ARE-NLS-Cre-EGFP、pET14b-HDG-NLS-Cre-EGFP、pET14b-HPT-NLS-Cre-EGFP和pET14b-TVL-NLS-Cre-EGFP;(5)成功分離得到Cdc42基因兩端帶LoxP位點(diǎn)的C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞;(6)融合蛋白His-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP內(nèi)化Cdc42基因兩端帶LoxP位點(diǎn)的C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞成功敲除了目的基因。綜上所述,本論文首先驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的152條CPPs對MEF細(xì)胞的內(nèi)化能力；然后利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測了多肽的理化性質(zhì),分析挖掘了內(nèi)化能力和多肽理化性質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)；同時(shí)挑選出強(qiáng)內(nèi)化能力的5個(gè)多肽,利用M5在MEF細(xì)胞系進(jìn)行內(nèi)化效率比較；其次成功構(gòu)建了含NLS-Cre-Tat的重組原核質(zhì)粒,體外表達(dá)純化外源蛋白充當(dāng)基因敲除的載體,實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞水平上對目的基因的敲除。上述工作為組織或動物水平的基因敲除技術(shù)做出了有益的探索,也拓寬了CPPs未來在基因操作和治療中的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：穿透肽 內(nèi)化 核定位信號 Cre重組酶 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 前言15-20
• 第二章 材料與方法20-31
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2.2 質(zhì)粒、菌株21
• 2.3 主要試劑配制21-23
• 2.4 主要儀器23-24
• 2.5 方法24-31
• 第三章 結(jié)果31-43
• 3.1 多肽內(nèi)化MEF細(xì)胞31-34
• 3.2 生物信息學(xué)分析34-37
• 3.3 BCA法蛋白定量結(jié)果37
• 3.4 多肽內(nèi)化MEF細(xì)胞比較37-38
• 3.5 代表性多肽的原核表達(dá)和純化38-39
• 3.6 重組原核表達(dá)載體的鑒定39-40
• 3.7 His-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP原核表達(dá)及純化40
• 3.8 Cdc42基因兩端帶LoxP位點(diǎn)C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離40-41
• 3.9 融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞效率的觀察41-42
• 3.10 融合蛋白內(nèi)化細(xì)胞敲除基因的效果檢測42-43
• 第四章 討論43-50
• 4.1 多肽的內(nèi)化篩選優(yōu)化及內(nèi)化能力影響因子的分析43-47
• 4.2 基因敲除技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用47-48
• 4.3 CPP與Cre-LoxP系統(tǒng)的結(jié)合48-50
• 第五章 全文小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 在讀碩士期間發(fā)表的文章55-56
• 英文縮略詞表56-58
• 致謝58-59

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