本文關鍵詞：HCMV重組嵌合抗原表達及其診斷初步應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：選用人巨細胞病毒（HCMV）抗原性強且親水性高的基因片段構建的三種重組嵌合抗原，誘導、表達、純化獲得目的蛋白；采用ELISA法檢測合肥地區(qū)孕婦、兒童等血清HCMV的感染情況，并平行比較構建的三種重組嵌合抗原的敏感性和特異性，并分析感染HCMV的孕婦、兒童、腫瘤疾病等相關危險因子。 方法：通過Protean軟件分析了的HCMV UL32、UL44、UL55、UL83、UL123序列，通過設計合理引物，各基因片段用Overlap PCR方法連接，并引入Bgl II、BamHI酶切位點，成功構建這三種重組質粒且經(jīng)誘導表達，重組蛋白用Ni2+NTA親和層析的方法純化獲得：HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123。采用Western blot法檢測免疫反應性。利用這三種重組蛋白作為抗原建立和優(yōu)化了HCMV血清學檢測ELISA方法，檢測安徽合肥地區(qū)76例孕婦、150例呼吸道疾病兒童和43例腫瘤患者的血清。運用SPSS16.0軟件對其結果進行分析處理。 結果：成功構建了HCMV重組嵌合抗原表達質粒，并能夠誘導表達于大腸桿菌中，，并且也較高純度的純化出了目的蛋白，驗證其具有較強的免疫反應性，建立重組抗原ELISA檢測方法。與商業(yè)試劑盒比較其重組抗原的敏感度、特異性均為100%，而商業(yè)試劑盒的特異性為100%,敏感度為97.6%。 ①孕婦血清HCMV IgG陽性率為55.3%，其中，孕周在19~21周的孕婦感染率為75%，Logistic回歸分析結果顯示：HCMV感染率與孕婦孕周、年齡、AFP（甲胎蛋白）、HCG（人絨毛膜促性腺激素）、游離雌三醇（uE3）水平以及糖尿病均無顯著差異性（P＞0.05）。②兒童血清HCMV陽性率為32.7%，Logistic回歸分析結果顯示：兒童年齡、淋巴細胞百分比水平及呼吸道感染中患MPP（肺炎支原體肺炎）與HCMV感染率之間有顯著相關性（P＜0.05）；而性別、WBC（白細胞）、RBC（紅細胞）、PLT（血小板）、CPR（C反應蛋白）水平與HCMV感染率之間均無顯著相關性（P＞0.05）。呼吸道疾病兒童血清KSHV陽性率為16.7%，Logistic回歸分析結果顯示：兒童年齡、性別、WBC、RBC、PLT、淋巴細胞百分比及CRP水平與感染率之間均無明顯相關性（P＞0.05）。③腫瘤患者HCMV陽性率為20.9%，其感染HCMV陽性的有9例，Logistic回歸分析結果顯示：年齡、性別、腫瘤均與HCMV感染率無顯著相關性（P＞0.05）。④腫瘤患者KSHV陽性率為30.2%，其感染HCMV陽性的有13例，Logistic回歸分析結果顯示：腫瘤與KSHV感染率有顯著相關性（P＜0.05）。 HCMV IgG血清抗體陽性率與KSHV血清抗體陽性率之間比較，150份兒童血清中，HCMV IgG抗體陽性率為32.7%，KSHV抗體陽性率為16.7%，兩抗體陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.93, P=0.002）。76例孕婦的血清HCMV IgG抗體陽性率為55.3%，KSHV感染陽性率為1.3%，兩抗體陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=39.09, P=0.000）。43例腫瘤患者的血清中HCMV感染率為20.9%，KSHV感染率為30.2%，兩抗體陽性率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.125，P=0.289）。 結論：構建了HCMV重組嵌合抗原表達質粒，并成功誘導表達于大腸桿菌中，且也較高純度的純化出了目的蛋白，驗證其具有較強的免疫反應性，建立重組抗原的檢測方法。在血清學檢測中HCMV感染率與孕婦的孕周、AFP、HCG及雌激素水平均無相關性；其中肺炎支原體肺炎與HCMV感染率相關，以及在10.01～１2月和淋巴細胞比例大于40.01%均與HCMV感染率有顯著相關性；提示HCMV感染與呼吸道感染之間有密切關系，認為可能是由于兒童HCMV活動期感染導致肺功能下降，免疫力低下誘發(fā)支原體肺炎的發(fā)生，誘使呼吸道感染反復發(fā)作；也可能是兒童MPP感染使免疫功能改變，增加其它病原菌對機體的侵襲。
【關鍵詞】：人巨細胞病毒 卡波氏肉瘤相關皰疹病毒 血清感染 肺炎支原體肺炎
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 前言13-15
• 2 材料與方法15-25
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 質粒和菌株15-16
• 2.1.2 血清樣本16
• 2.1.3 試劑16
• 2.1.4 儀器和設備16-17
• 2.2 方法17-25
• 2.2.1 溶液的配制17-21
• 2.2.2 感受態(tài) BL21(DE3)的制備21
• 2.2.3 重組質粒的轉化21-22
• 2.2.4 目的蛋白誘導表達22
• 2.2.5 目的蛋白 SDS-PAGE 電泳及考馬斯染色和脫色22
• 2.2.6 Ni-NTA 純化目的蛋白22-23
• 2.2.7 純化樣品 SDS-PAGE 電泳與濃度檢測23
• 2.2.8 重組蛋白經(jīng) Western blot 檢測其免疫反應23
• 2.2.9 H C M V 感染孕婦和兒童血清的 E L I S A 法檢測及條件優(yōu)化23-24
• 2.2.10 HCMV 重組嵌合抗原血清學檢測24
• 2.2.11 孕婦、兒童及腫瘤患者血清學 HCMV 與 KSHV 感染率比較24
• 2.2.12 統(tǒng)計學分析24-25
• 3 結果25-45
• 3.1 各融合基因片段的 PCR 鑒定25-26
• 3.2 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 重組質粒的鑒定26-31
• 3.3 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 的表達與純化31-33
• 3.4 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 免疫反應性分析33-34
• 3.5 診斷的初步應用以 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 蛋白為抗原的 ELISA 體系建立與優(yōu)化34-35
• 3.6 安徽地區(qū) HCMV 孕婦及兒童等血清學檢測結果35-45
• 3.6.1 合肥地區(qū) HCMV 孕婦血清學敏感性、特異性檢測結果35-36
• 3.6.2 合肥地區(qū)孕婦 HCMV 血清檢測結果36-38
• 3.6.3 合肥地區(qū)兒童 HCMV 血清學檢測結果38-40
• 3.6.4 合肥地區(qū)兒童 KSHV 血清學檢測結果40-42
• 3.6.5 合肥地區(qū)腫瘤患者 HCMV 血清檢測結果42-43
• 3.6.6 合肥地區(qū)腫瘤患者 KSHV 血清檢測結果43
• 3.6.7 HCMV 血清陽性率與 KSHV 血清陽性率之間比較43-45
• 4 討論45-50
• 5 結論50-52
• 5.1 HCMV 重組嵌合抗原的構建與表達50-51
• 5.2 診斷應用重組嵌合抗原作為包被抗原檢測合肥地區(qū)孕婦、支原體肺炎兒童血清 HCMV 感染率51-52
• 參考文獻52-58
• 附錄58-59
• 致謝59-60
• 綜述 HCMV 相關基因在母嬰共感染、移植及其它疾病中的研究與進展60-68
• 參考文獻65-68

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：HCMV重組嵌合抗原表達及其診斷初步應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：334877