目的篩選有效的siRNA序列,研究靶向負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H4的特異性小干擾RNA（siRNA）對小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞株C3H10 T1/2（C3H10）中B7-H4表達(dá)的抑制作用,探討C3H10細(xì)胞中B7-H4的免疫抑制作用及對小鼠淋巴細(xì)胞活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（AIDC）的影響。方法應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR及Western blot等方法檢測C3H10細(xì)胞中B7-H4的表達(dá)情況;設(shè)計(jì)并合成三對針對小鼠B7-H4基因的特異性siRNA和綠色熒光素標(biāo)記的FAM-siRNA陰性對照序列,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染入C3H10細(xì)胞;通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀（FCM）檢測表達(dá)綠色熒光素的C3H10細(xì)胞評估siRNA的轉(zhuǎn)染效率;利用RT-PCR和Western blot的方法測定不同序列的特異性siRNA干預(yù)C3H10細(xì)胞后B7-H4的mRNA及蛋白表達(dá)水平,篩選出具有最大抑制作用的siRNA為最佳序列;利用RT-PCR確定最佳轉(zhuǎn)染濃度;B7-H4靶向siRNA干預(yù)C3H10后,與小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),用FCM行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及檢測淋巴細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

免疫熒光檢測B7-H4蛋白在C3H10細(xì)胞中的表達(dá)情況，倒置顯微鏡觀察拍照(×200)

DAPI 染色法染細(xì)胞核，我們可以清晰的看到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的綠色熒光（圖 2a-A），同一視野下細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（圖2a-B），疊加處理兩張圖片（圖 2a-C）可見轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到 80%。流式細(xì)胞儀檢測 siRNA-FAM 10nM、20nM 和 50nM 轉(zhuǎn)染效率，經(jīng) WinMDI 2.9軟件分析，M2 的數(shù)值代表陽性轉(zhuǎn)染率，顯示轉(zhuǎn)染 siRNA-FAM 10nM、20nM 和 50nM轉(zhuǎn)染效率分別為 72.43%、78.65%和 86.43%（圖 2b）。圖 2a siRNA-FAM 50nM 轉(zhuǎn)染 C3H10 細(xì)胞倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，并拍照(×100)。（A）：A 暗場下 siRNA-FAM（綠色）；（B）：DAPI 染色法染細(xì)胞核（藍(lán)色）；（C）：（A）和（B）兩者疊加；（D）：同一視野下明場拍照。3.siRNA 下調(diào) C3H10 中 B7-H4 的表達(dá)3.1 western blot 檢測轉(zhuǎn)染的 C3H10 細(xì)胞下調(diào) B7-H4 蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染各組 siRNA-B7-H4 50nM，72h 后收集細(xì)胞，Western blot 檢測 B7-H4 蛋白的

設(shè)空白對照(Blank)和 siRNA 陰性對照（siRNA-N.C.）,選 GAPDH 作為內(nèi)參。由圖 3.1 可以看到，與對照組相比，轉(zhuǎn)染 siRNA-1 后 B7-H4 蛋白表達(dá)量明顯下降。圖2b 不同濃度siRNA-FAM轉(zhuǎn)染C3H10細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。（A）:未轉(zhuǎn)染 siRNA-FAM 的空白對照；（B）:轉(zhuǎn)染 siRNA-FAM 10nM；（C）:轉(zhuǎn)染siRNA-FAM 20nM；（D）:轉(zhuǎn)染 siRNA-FAM 50 nM。圖 3.1 50nM 各組 siRNA 轉(zhuǎn)染 C3H10 細(xì)胞 Western blot 檢測 B7-H4 蛋白分子表達(dá)情況。Blank：空白對照；N.C.：轉(zhuǎn)染陰性對照 siRNA；siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3：分別為轉(zhuǎn)染干擾目的分子 B7-H4 的三對不同位點(diǎn)的 siRNA。3.2 RT-PCR 檢測 siRNA 轉(zhuǎn)染 C3H10 細(xì)胞 B7-H4 表達(dá)下調(diào)轉(zhuǎn)染各組 siRNA-B7-H4 50nM，72h 后收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞中的 RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，RT-PCR 檢測 C3H10 細(xì)胞 B7-H4 mRNA 的表達(dá)情況。設(shè)空白對照(Blank)和

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Recombinant human B7-H4 expressed in Escherichia coli inhibits T lym-phocyte proliferation and IL-2 secretion in vitro[J]. Yi-xiang MAO~(2,3)Yong-Jing CHEN~2 Yan GE~2 Hong-bing MA~2 Jian-feng YU~2 Hong-ya WU~2 Yu-min HU~2 Qin WANG~2 Qin SHI~2 Xue-guang ZHANG~(2,4)2 Institute of Biotechnology,Soochow University,Suzhou 215007,China;3 Department of Oncology,First Affiliated Hospital to Soochow University,Suzhou 215007,China.  Acta Pharmacologica Sinica. 2006(06)



本文編號：3343932