目的探討PAX6對小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ESCs）增殖的影響及其機制。方法用過表達(dá)PAX6慢病毒重組質(zhì)粒載體感染mESCs,上調(diào)mESCs中PAX6的表達(dá);采用CCK8檢測PAX6對mESCs增殖的影響;采用流式細(xì)胞儀檢測PAX6對mESCs周期的影響;采用葡萄糖生化試劑盒和ATP檢測試劑盒分別檢測mESCs葡萄糖和ATP含量;Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-P70S6K、P70S6K、GLUT1的表達(dá)。結(jié)果慢病毒重組質(zhì)粒載體感染后,PAX6過表達(dá)組mESCs較對照組PAX6表達(dá)增加,細(xì)胞增殖受到抑制,并出現(xiàn)G1期阻滯（二倍體含量百分率55.54±1.00%vs 41.12±0.63%,P<0.05）;與對照組比較,PAX6過表達(dá)減少mESCs中ATP（277.7±14.3 vs 804.4±13.4 umol/gprot,P<0.05）及葡萄糖含量（2.55±0.16 vs 5.16±0.15 mmol/L,P<0.05）;與對照組相比,PAX6過表達(dá)組、... 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(08)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

圖１培養(yǎng)的ｍＥＳＣｓ光鏡下形態(tài)（１００×）ＡｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＭＥＦｆｅｅｄｉｎｇｌａｙｅｒＢｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｏｕｔＭＥＦｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒＣａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）ｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＡ含ＭＥＦ飼養(yǎng)層培養(yǎng)的ｍＥＳＣｓＢ脫ＭＥＦ飼養(yǎng)層培養(yǎng)的ｍＥＳＣｓＣｍＥＳＣｓ堿性磷酸酶（ＡＰ）

ｓ．Ｆｉｇ．１ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍＥＳＣｓｕｎｄｅｒｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１００×）圖２顯示，使用單克隆抗體ＳＳＥＡ１ｍｏｕｓｅｍＡｂ加ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ－ＣＹ３，ＯＣＴ４ｒａｂｂｉｔｍＡｂ加ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ－ＣＹ３染色后，可見ｍＥＳＣｓ胞質(zhì)內(nèi)有ＯＣＴ４表達(dá)（紅色熒光），細(xì)胞胞膜有ＳＳＥＡ１表達(dá)（紅色熒光）。表明ｍＥＳＣｓ仍處于未分化狀態(tài)，具有多能性，具備胚胎干細(xì)胞的特征。圖２ｍＥＳＣｓ免疫熒光染色檢查ＯＣＴ４及ＳＳＥＡ１的表達(dá)Ｆｉｇ．２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯＣＴ４ａｎｄＳＳＥＡ１ｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｍＥＳＣｓ２ＰＡＸ６對細(xì)胞增殖的影響２．１ＰＡＸ６的過表達(dá)為研究ＰＡＸ６在ｍＥＳＣｓ中的作用，采用慢病毒重組質(zhì)粒載體感染ｍＥＳＣｓ的方法上調(diào)ｍＥＳＣｓ中ＰＡＸ６的表達(dá)。如圖３所示，ＰＡＸ６過表達(dá)組ｍＥＳＣｓ中可見ＰＡＸ６表達(dá)（紅色熒光），對照組與過表達(dá)空載體組未見ＰＡＸ６熒光表達(dá)，過表達(dá)空載體組與ＰＡＸ６過表達(dá)組可見ＧＦＰ綠色熒光。采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測各組ｍＥＳＣｓ中ＰＡＸ６的表達(dá)，結(jié)果·１９６·中國病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年８月第１４卷第８期Ａｕｇ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８

見圖４。過表達(dá)組ＰＡＸ６蛋白表達(dá)較對照組和過表達(dá)空載體組明顯增加，ｍＥＳＣｓ感染ＰＡＸ６過表達(dá)載體成功。圖３ｍＥＳＣｓ免疫熒光染色中ＰＡＸ６及ＧＦＰ的表達(dá)Ｆｉｇ．３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ６ａｎｄＧＦＰｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｍＥＳＣｓ圖４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測ＰＡＸ６蛋白相對表達(dá)量Ｆｉｇ．４ＲｅｌａｔｉｖｅｌｙｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ６２．２ＰＡＸ６對ｍＥＳＣｓ增殖的影響采用ＣＣＫ８法測定ＰＡＸ６對ｍＥＳＣｓ增殖能力的影響，結(jié)果見圖５。在２４ｈ及４８ｈ兩個時間點均觀察到ＰＡＸ６過表達(dá)抑制ｍＥＳＣｓ的增殖。提示ＰＡＸ６具有抑制ｍＥＳＣｓ增殖的作用。２．３流式細(xì)胞術(shù)檢測ＰＡＸ６對ｍＥＳＣｓ周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖６。與對照組相比，ＰＡＸ６過表達(dá)組ｍＥＳＣｓ出現(xiàn)Ｇ１期阻滯，過表達(dá)空載組與對照組之間無明顯不同。圖５ＣＣＫ８法測ｍＥＳＣｓ增殖情況Ｆｉｇ．５ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓＡｍＥＳＣｓ流式細(xì)胞術(shù)圖Ｂ３組細(xì)胞二倍體含量比較圖６ＰＡＸ６對ｍＥＳＣｓ細(xì)胞周期的影響ＡＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆｍＥＳＣｓＢＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ２－ｐｌｏｉｄｙｃｏｎｔｅｎｔｉｎａｌｌｇｒｏｕｐｓＦｉｇ．６ＥｆｆｅｃｔｏｆＰＡＸ６ｏｎｍＥＳＣｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅ３ＰＡＸ６干擾能量代謝作用３．１ＰＡＸ６對ｍＥＳＣｓ中ＡＴＰ和葡萄糖含量的影響分別采用ＡＴ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]靶向沉默Pax6基因表達(dá)抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖侵襲的機制研究[J]. 祁海燕,冷非,蘇學(xué)剛.  臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志. 2017(16)
[2]Limbal stem cells: Central concepts of corneal epithelial homeostasis[J]. Jinny J Yoon,Salim Ismail,Trevor Sherwin.  World Journal of Stem Cells. 2014(04)

博士論文
[1]替莫唑胺通過調(diào)控miR-223/PAX6抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的研究[D]. 程全.中南大學(xué) 2014



本文編號：3322970