本文關(guān)鍵詞：中緬邊境惡性瘧原蟲對五種抗瘧藥的敏感性測定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 1.測定2007-2011年云南省中緬邊境瘧疾流行區(qū)佤邦以及2011年克欽邦惡性瘧原蟲對五種抗瘧藥咯萘啶、萘酚喹、甲氟喹、本芴醇和乙胺嘧啶的IC50(half maximal inhibitory concentration)值,并分析不同年份間藥物敏感性的趨勢。 2.利用巢式PCR擴(kuò)增樣本多藥物抗性基因pfmdr1并進(jìn)行序列測定、找出突變位點(diǎn)；比較佤邦和克欽邦基因位點(diǎn)的突變情況及兩地區(qū)間的差異。 3.進(jìn)一步優(yōu)選和完善4℃冷藏方法條件以用于惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)的同步化。 方法： 1.利用巢式PCR基因擴(kuò)增方法,擴(kuò)增惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein1, MSP1)和裂殖子表面蛋白2(merozoite surface protein2, MSP2)基因,鑒定2007-2011年間佤邦地區(qū)混合感染株。對確定的23例混合感染株及2011年克欽邦3例單一感染株,進(jìn)行體外培養(yǎng)。對于佤邦樣本,根據(jù)混合感染蟲株間互相競爭的原理,判斷長時(shí)間培養(yǎng)過程中是否能成為單一感染株。對單一株測定藥物敏感性。 2.培養(yǎng)單一感染的瘧原蟲蟲株,至環(huán)狀體百分比70%、原蟲感染率1%時(shí),進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。在96孔培養(yǎng)板中加入稀釋好濃度梯度的抗瘧藥,調(diào)整原蟲密度至0.5%,紅細(xì)胞壓積2%,加入96孔培養(yǎng)板中,放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí),隨后-20℃凍存。一周內(nèi),應(yīng)用SYBR Green I體外熒光法,測其IC50值。用此方法分別測定23株佤邦樣本和3株克欽邦樣本對咯萘啶、萘酚喹、甲氟喹、本芴醇和乙胺嘧啶五種抗瘧藥的ICs0值。為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,每個(gè)藥板中加入標(biāo)準(zhǔn)株作對照,每個(gè)樣本重復(fù)三次。將測定出的熒光值整理、計(jì)算為原蟲生長抑制率后輸入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Prism5.0得出IC50值,95%可信區(qū)間及S型抗藥曲線。小于或等于3D7標(biāo)準(zhǔn)株的IC50值的定為敏感,大于抗性臨界IC50值的為敏感性降低。按此標(biāo)準(zhǔn)分析數(shù)據(jù),得出佤邦地區(qū)2007-2011年的抗藥性趨勢。 3.測定佤邦和克欽邦樣本的pfmdrl基因序列,找出突變位點(diǎn),分析兩地區(qū)pfmdrl基因位點(diǎn)突變情況差異,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。 4. Percoll-Sorbitol梯度純化法獲得瘧原蟲裂殖體,并通過4℃冷藏法驗(yàn)證裂殖體是否能夠耐受4℃低溫,為該同步化方法的原蟲時(shí)期選擇和狀態(tài)判斷奠定基礎(chǔ)。分別記錄4℃同步化前后4株標(biāo)準(zhǔn)株和4株病人株環(huán)狀體的感染率,每株樣本重復(fù)三次,分析標(biāo)準(zhǔn)株和病人株同條件下(4℃冷藏處理)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用4℃同步化分別處理標(biāo)準(zhǔn)株3D7三個(gè)不同環(huán)狀體感染率區(qū)間(30-50%,50-70%,70%),觀察同步化的效果,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析此同步化方法對不同環(huán)狀體感染率影響有無差異。 結(jié)果： 1.佤邦23株混合感染病人株經(jīng)培養(yǎng)后變?yōu)閱我恢甑?在第20天有5株；第30天有8株；第40天有8株；第50天有1株；第90天有1株。 2.佤邦地區(qū)23株(2007-2011)和克欽邦3株(2011)樣本對五種抗瘧藥的體外敏感IC50值為：咯萘啶(3.2±1.8nM)、萘酚喹(5.9±4.0nM)、甲氟喹(51.6±33.7nM)、本芴醇(2.4±1.5nM)和乙胺嘧啶(2907.1±2109.3nM)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析說明瘧原蟲對五種藥的敏感率不同(P0.005),對咯萘啶、萘酚喹、甲氟喹和本芴醇仍為敏感,而對乙胺嘧啶已有嚴(yán)重抗性,且抗性隨年份逐漸增加,2010年抗性率均已達(dá)100%。單獨(dú)對克欽邦2011年3株樣本的ICs0值分析,發(fā)現(xiàn)其對五種抗瘧藥均為敏感或敏感度輕微下降。對佤邦年份間抗藥性分析比較發(fā)現(xiàn)對咯萘啶、甲氟喹和乙胺嘧啶的敏感性年份間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;對萘酚喹和本芴醇的敏感性年份間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但都只限于一個(gè)年份有抗性株的出現(xiàn),其余三個(gè)年份敏感率均為100%。 3.在pfmdrl測序的38株樣本中(960bp片段有兩個(gè)樣本未測序成功),佤邦樣本有21株,克欽邦樣本有17株。其中12株佤邦樣本和8株克欽邦樣本有突變位點(diǎn)。第86氨基酸位點(diǎn)突變的樣本有8株(突變率21.1%),其中7株來自佤邦,1株來自克欽邦。第130氨基酸位點(diǎn)突變的樣本有3株(突變率7.9%)均來自佤邦。第184氨基酸位點(diǎn)突變的樣本有8株(突變率21.1%),其中6株來自克欽邦,2株來自佤邦。第1042氨基酸位點(diǎn)突變的僅有1株(突變率2.8%),來自佤邦�？藲J邦樣本F08B35發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變位點(diǎn)173(突變率2.6%)。僅有一株佤邦樣本(WBLH5)有兩個(gè)點(diǎn)突變,突變型為Y184F/N1042D。另外19株為單一位點(diǎn)突變,剩余18株為野生型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,佤邦和克欽邦地區(qū)突變率差異不顯著(χ2=0.38,0.5P0.75)。 4.對瘧原蟲低溫冷藏同步化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),裂殖體不耐受4℃低溫冷藏。對環(huán)狀體百分比在37.5-44.1%之間的蟲株,冷藏9-24h后,可達(dá)到77.0-85.6%環(huán)狀體,且重復(fù)性較好。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同步化前后標(biāo)準(zhǔn)株和病人株環(huán)狀體百分比變化,P=0.194,說明兩種蟲株經(jīng)過4℃同步化處理后環(huán)狀體率無顯著差異。4℃同步化處理三個(gè)不同環(huán)狀體百分比區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)株3D7,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析說明不同環(huán)狀體感染率瘧原蟲經(jīng)4℃同步化處理后效果無顯著性差異(F=1.990,P=0.217)。 結(jié)論： 1.混合感染株經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng),可以逐漸變?yōu)閱我桓腥局辍６掖蟛糠衷?0天內(nèi)變?yōu)閱我恢辍?2.佤邦地區(qū)(2007-2011)惡性瘧原蟲對咯萘啶、萘酚喹和甲氟喹仍為敏感,但敏感性有所下降;對本芴醇總體看仍為敏感,但對乙胺嘧啶已有嚴(yán)重抗性,2010年抗性率為100%�？藲J邦地區(qū)(2011)對五種抗瘧藥仍較敏感,只有個(gè)別蟲株敏感性輕微下降。 3.佤邦和克欽邦兩個(gè)瘧疾流行區(qū)的pfmdr1位點(diǎn)突變率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異�；蛲蛔冃桶俜致拾磸拇蟮叫∨帕袨椋篘86Y=Y184FG130KN1042DN173K。 4.對培養(yǎng)的瘧原蟲4℃冷藏可以殺滅裂殖體。4℃冷藏同步化法操作簡單,降低了污染的可能性,可以達(dá)到藥敏試驗(yàn)的選蟲標(biāo)準(zhǔn),其同步化效果和山梨醇同步化法相似。病人株和標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)4℃同步化處理后均可達(dá)到預(yù)期效果；不同環(huán)狀體感染率(30%)瘧原蟲經(jīng)4℃同步化處理后效果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
【關(guān)鍵詞】：惡性瘧原蟲 pfmdr1基因 抗藥性 4℃同步化法 IC_(50)
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R382.31
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-19
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法19-42
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑來源及配制19-24
• 3 試驗(yàn)方法與步驟24-42
• 結(jié)果42-54
• 1 混合感染株經(jīng)培養(yǎng)變?yōu)閱我桓腥局甑挠涗浗Y(jié)果42-43
• 2 pfmdr1基因擴(kuò)增結(jié)果43-46
• 3 五種抗瘧藥的IC_(50)值測定結(jié)果及蟲株抗藥性分析46-51
• 4 4℃冷藏同步化實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-54
• 討論54-57
• 1 分子技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用54-55
• 2 抗藥性測定和IC_(50)值55-56
• 3 交叉抗藥性56
• 4 4℃冷藏同步化法56-57
• 結(jié)論57-58
• 實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性58-59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 綜述63-71
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 碩士在讀期間發(fā)表文章71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張蒼林;周紅寧;王劍;劉慧;;中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲對氯喹、哌喹、咯萘啶敏感性的體外測定[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2012年01期

  本文關(guān)鍵詞：中緬邊境惡性瘧原蟲對五種抗瘧藥的敏感性測定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：331342