本文關(guān)鍵詞：不同蛔蟲抗原刺激DC差異性對T細胞亞群活性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 通過用兩種蛔蟲抗原體外刺激樹突狀細胞（Dendritic Cell, DC）,檢測DC表面分子的差異和與之共同培養(yǎng)的淋巴細胞中細胞因子IL-10、TNF-及Foxp3mRNA表達量變化，以探討兩種蛔蟲抗原刺激DC介導T細胞亞群活性及其產(chǎn)生的差異，了解不同蛔蟲對宿主寄生特異性的免疫機制。 方法： 1、蛔蟲抗原的制備：將人蛔蟲、豬蛔蟲蟲體制成勻漿，經(jīng)20,000rpm離心30min，去除組織糜沉淀，取上清過0.4μm濾膜除菌，用核酸/蛋白分析儀檢測其蛋白濃度，并排除內(nèi)毒素污染后，分裝后置-30℃凍存?zhèn)溆?2、實驗分組：實驗設(shè)計7個組，分別為3個不同濃度的人蛔蟲抗原應用液刺激DC組（H1-DC、H2-DC及H3-DC）；3個不同濃度的豬蛔蟲抗原應用液刺激DC組（P1-DC、P2-DC及P3-DC）和僅有DC誘導體系（不含任何抗原）空白對照組（K-DC）。人、豬蛔蟲抗原的3個梯度濃度都分別為10g/ml、100g/ml和200g/ml。 3、骨髓DC的誘導培養(yǎng)：取C57BL/6小鼠的肱骨、脛骨和股骨，用500U/ml雙抗（青霉素和鏈霉素）PBS浸泡清洗后剪斷骺端，用RPMI1640液抽吸將骨髓沖出，將所得細胞過200目鋼網(wǎng)成單個細胞，而后用紅細胞裂解液處理，洗滌2遍后，用DC誘導體系定容制成細胞懸液，按3×107/孔接入六孔板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后，，吸棄懸浮細胞，加入同體系培養(yǎng)液4ml/孔。每天半量換液，第6天收集DC（取一份作為流式細胞檢測的初始DC來源）。 4、蛔蟲抗原刺激DC：將第6天收集懸浮DC細胞,按實驗分組分別加入不同濃度蛔蟲抗原培養(yǎng),細胞密度為8×104/ml，48小時后收集懸浮細胞，即為刺激后DC (H1-DC、H2-DC、H3-DC和P1-DC、P2-DC、P3-DC及K-DC)。 5、FCM檢測DC表面分子的表達：分別收集初始DC和P1-DC、H1-DC和K-DC,用PBS洗后，用0.3%疊氮鈉溶液重懸，各組加入相應量的anti-CD11c PE、anti-CD83FITC、anti-CD80PE-Cy5及anti-CD86PE，混合后4℃避光反應半小時以上，用流式上樣緩沖液清洗后上機。 6、脾淋巴細胞分離：用淋巴細胞分離液處理小鼠的脾臟的單細胞懸液，洗滌2遍后用含10%FBS的RPMI1640調(diào)整細胞濃度為1×107/ml，接于6孔板（4ml/孔），放入37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4小時，收集懸浮細胞備用。 7、ELISA檢測細胞因子：將收集的各組抗原刺激DC及K-DC用25μg/ml絲裂霉素C處理，而后按1:25的數(shù)量比混合脾淋巴細胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24h、48h、72h取1板水平離心（2,000r/min、15min）,收集上清，而后對收集的各組上清，用ELISA法檢測Th1/Th2細胞因子(TNF-/IL-10)的表達。 8、熒光定量PCR：取中濃度抗原刺激的DC（H2-DC、P2-DC）和K-DC經(jīng)絲裂霉素C處理后，與脾淋巴細胞細胞按1:25比例混合培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h收集細胞，用TRIzol溶解收集，于-30℃保存。按TRIzol一步法抽提總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度。按Invitrogen的M-MLV第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按SYBGreen試劑盒進行定量PCR擴增,以cyclophilin-A作為內(nèi)參。反應條件為：50℃2min，90℃2min及95℃15s，60℃30s，反應50個循環(huán)。每組標本設(shè)3個復孔，以K-DC組第1天的表達量為對照，計算Foxp3mRNA的相對表達量RQ值即2-Ct。 9、統(tǒng)計學分析：利用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，采用one-way ANOVA和UNIANOVA分析，結(jié)果用x s表示 結(jié)果： 1、FCM法檢測DC表面分子的表達：FCM檢測四組DC表面CD11c、CD80、CD86及CD83的表達水平，分離所得CD11c表達比例96.93%的DC；兩種蛔蟲抗原都會影響DC表面活性分子的表達，相對于K-DC，P1-DC組各分子表達量都明顯下降，而H1-DC組則有一定程度的升高。 2、ELISA檢測Th1/Th2細胞因子表達：除H3-DC外，各時間段實驗組TNF-的表達量都低于對照組（K-DC），且都有顯著性差異（P0.05）。低濃度組及高濃度組除24h段與72h段外，各時間段，相同濃度的兩種抗原刺激組間沒有顯著差異（P0.05）。而IL-10在各組的表達量隨時間延長而增加；各時間段的相同濃度除24h外，人蛔蟲抗原組高于豬蛔蟲抗原組（P0.05）。 3、熒光定量PCR分析Foxp3mRNA的相對表達水平：相對于H2-DC組Foxp3mRNA的表達量，K-DC和P2-DC組各個時間段都較低，且都與前者存在差異性（P0.05）。H2-DC組的表達量在短期內(nèi)增加明顯，但又隨時間而減少。P2-DC組則先增后減，但都與K-DC組間無差異性（P0.05）。 結(jié)論： 1、兩種蛔蟲抗原對DC表面分子表達量的均有刺激作用。但是兩者表現(xiàn)不同：豬蛔蟲抗原表現(xiàn)為抑制DC表面分子表達，而人蛔蟲抗原則促進DC表面分子表達。 2、兩種蛔蟲抗原刺激的DC均可促進淋巴細胞的Th1/Th2免疫平衡向Th2偏移，但人蛔蟲抗原的效果更強。 3、不同蛔蟲抗原刺激的DC對Tregs活性的影響是不同的：人蛔蟲抗原刺激的DC促進Foxp3mRNA的表達，豬蛔蟲抗原刺激的DC不影響Foxp3mRNA的表達。
【關(guān)鍵詞】：人蛔蟲 豬蛔蟲 蛔蟲抗原 樹突狀細胞 T淋巴細胞 Foxp3
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R383;S855.9
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮寫一覽表12-13
• 第1章 引言13-16
• 1.1 人蛔蟲和豬蛔蟲比較研究現(xiàn)狀13-14
• 1.2 蛔蟲感染宿主免疫學研究進展14-16
• 第2章 材料與方法16-25
• 2.1 實驗動物、試劑與設(shè)備16-18
• 2.1.1 實驗動物及細胞株16
• 2.1.2 主要的實驗試劑16
• 2.1.3 主要的實驗設(shè)備16-17
• 2.1.4 主要的試劑配制17-18
• 2.2 實驗方法18-25
• 2.2.1 蛔蟲抗原的制備18
• 2.2.2 實驗分組18
• 2.2.3 骨髓 DC 的誘導培養(yǎng)18-19
• 2.2.4 DC 的形態(tài)學觀察19
• 2.2.5 蛔蟲抗原刺激髓源 DC19
• 2.2.6 FCM 檢測 DC 表面分子的表達19
• 2.2.7 脾淋巴細胞分離19-20
• 2.2.8 ELISA 法檢測細胞因子20-21
• 2.2.9 熒光定量 PCR 分析 Foxp3 mRNA 的相對表達水平21-24
• 2.2.10 統(tǒng)計學分析24-25
• 第3章 結(jié)果25-31
• 3.1 蛔蟲抗原的制備25
• 3.2 DC 的形態(tài)學特征25
• 3.3 FCM 法檢測 DC 表面分子的表達25-26
• 3.4 ELISA 檢測 Th1/Th2 細胞因子表達26-29
• 3.5 熒光定量 PCR 分析 Foxp3 mRNA 的相對表達水平29-31
• 第4章 討論31-36
• 4.1 兩種蛔蟲抗原差異性地調(diào)節(jié) DCs 表面分子表達31-32
• 4.2 不同蛔蟲抗原對 Th1/Th2 平衡的影響32-34
• 4.3 熒光定量 PCR 分析 Foxp3 mRNA 的相對表達水平34-36
• 第5章 結(jié)論36-37
• 致謝37-38
• 參考文獻38-42
• 附錄42-43
• 攻讀學位期間的研究成果43-44
• 綜述44-50
• 參考文獻48-50

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：330537