目的:探討抑制內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的自噬對于細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響,為EPCs治療深靜脈血栓提供一種新的思路。方法:1. Ficoll密度梯度離心法獲取Wistar大鼠的骨髓單個核細胞（bone marrow-derived mononuclear cells,BMMNCs）,內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基（EGM-2MV）體外誘導(dǎo)分化為EPCs并進行鑒定。2.實驗分五組,對照組及3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine 3-MA）四個濃度組,分別為1.25mmol/l、2.5mmol/l、5mmol/l、10mmol/l,采用常規(guī)四氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium MTT）比色法測定各濃度3-MA及對照組對EPCs增殖的作用。3.流式細胞儀檢測各濃度3-MA對EPCs凋亡率的影響及EPCs周期檢測。4.應(yīng)用單丹（磺）酰戊二胺（Monodansylcadaverine MDC）熒光染色和透射電鏡觀察3-MA給藥后EPCs自噬的發(fā)生及細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。5.Western blot檢測3-MA給藥... 

【文章來源】：蘇州大學江蘇省 211工程院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

剛分離的BMMNC呈圓形，較小，大小不一

浮狀態(tài)（圖1）。細胞很快開始貼壁，48h后部分細胞逐漸變大、伸展，未貼壁的細胞逐漸縮小、死亡。4-8d細胞生長迅速，處于對數(shù)生長期，形態(tài)多呈梭形、三角形、紡錘形及不規(guī)則形（圖2-3）。第10-12 天，細胞長滿培養(yǎng)瓶底，呈典型鋪路鵝卵石樣外觀（圖4）。此時的細胞數(shù)可達到（4.5±0.5）×105，能夠滿足實驗的需求。

8圖 3 第 7 天的 EPCs，細胞梭形，三角形，橢圓形及 圖 4 第 12 天的 EPCs，細胞長滿培養(yǎng)瓶，細胞間相互不規(guī)則外觀（×200） 連接，呈典型鵝卵石樣外觀（×200）2．EPCs免疫組化及免疫熒光鑒定選取目前比較公認的特異性標志VEGFR-2，CD34和CD133的表達情況進行免疫組化及免疫熒光鑒定，細胞表面標志VEGFR-2，CD34免疫組化檢測（圖5，6），陽性細胞胞漿呈棕黃色，細胞表面標志CD133免疫熒光鑒定（圖7），熒光顯微鏡下細胞呈藍綠色熒光。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3293265