目的構(gòu)建SSB蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒,在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行純化。方法以Hela細(xì)胞提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增出帶酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ的人SSB蛋白基因序列,經(jīng)酶切后插入PET41a質(zhì)粒中,構(gòu)建成GST-SSB-6*His-pet41a重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌OverExpress C41（DE3）中,經(jīng)異丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá),利用C端的His標(biāo)簽（Histag）進(jìn)行Ni-樹(shù)脂柱親和層析純化,SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達(dá)形式,蛋白印跡法（WB）鑒定重組蛋白的免疫原性,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）鑒定其免疫反應(yīng)性和特異性。結(jié)果 PCR擴(kuò)增獲得目的基因,菌落PCR示重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)化感受態(tài)OverExpress C41（DE3）后經(jīng)誘導(dǎo)有高效表達(dá),SDS-PAGE顯示GST-SSB-6*His重組蛋白為上清可溶性表達(dá),WB示重組蛋白有足夠的免疫原性,能與外周血中的抗SSB抗體發(fā)生特異性反應(yīng),特異性達(dá)100%。結(jié)論成功構(gòu)建了GST-SSB-6*His-PET41a重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后可純化出目... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)學(xué). 2019,48(14)

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 一般資料
    1.2 試劑
    1.3 方法
        1.3.1 引物設(shè)計(jì)、合成與PCR擴(kuò)增
        1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.3.3 SSB重組蛋白的表達(dá)形式
        1.3.4 GST-SSB-6*His重組蛋白的純化
        1.3.5 GST-SSB-6*His重組蛋白免疫原性驗(yàn)證
        1.3.6 GST-SSB-6*His重組蛋白用于ELISA檢測(cè)抗SSB抗體
        1.3.7 重組蛋白特異性驗(yàn)證
2 結(jié)果
    2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
    2.2 重組質(zhì)粒的菌落PCR及測(cè)序鑒定結(jié)果
    2.3 誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        2.3.1 重組蛋白表達(dá)形式鑒定
        2.3.2 重組蛋白大量表達(dá)后純化
        2.3.3 重組蛋白免疫原性鑒定
        2.3.4 重組蛋白用于ELISA檢測(cè)抗SSB抗體
        2.3.5 特異性鑒定
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2015年全國(guó)多中心自身抗體檢測(cè)質(zhì)量調(diào)查評(píng)價(jià)[J]. 胡朝軍,張蜀瀾,鄧垂文,李夢(mèng)濤,曾小峰.  中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志. 2016(02)
[2]重視自身抗體檢測(cè)質(zhì)量管理和臨床應(yīng)用[J]. 胡朝軍,李永哲.  中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2013 (08)



本文編號(hào)：3292896