本文關鍵詞：霍亂弧菌CRP的碳源利用與甘露醇發(fā)酵轉錄水平的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的研究霍亂弧菌中CRP（cAMP receptor protein）調節(jié)蛋白、環(huán)腺苷酸受體蛋白（cAMP receptor protein CRP）對高絲氨酸脫氫（homoserine dehydrogenaseisozymes, HDH）是否具有調控作用。 CRP蛋白在調節(jié)多個通路，特別是在碳源代謝中發(fā)揮重要作用，同時CRP-cAMP亦調控著霍亂弧菌甘露醇mtl操縱子，其中mtl操縱子主要是霍亂弧菌O1群El Tor型產(chǎn)毒株（主要為甘露醇慢發(fā)酵株）和非產(chǎn)毒株（主要為甘露醇快發(fā)酵株）的調控因子。研究霍亂弧菌甘露醇發(fā)酵基因mtlA、mtlD轉錄水平差別，用實驗數(shù)據(jù)證實兩種類型菌株對甘露醇發(fā)酵快慢的原理。在試驗中比較霍亂弧菌El Tor型的產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株兩類菌株在甘露醇發(fā)酵液試驗中操縱子基因mtA、mtlD的RNA轉錄水平差異，它是否普遍存在于不同年代和不同地區(qū)的菌株中，及其蛋白表達是否也具有相同的差異性。 方法采用基因搭橋與菌株構建的方法。通過搭橋PCR將HDH基因啟動子中CRP潛在結合位點替換為CRP保守結合位點，分別將替換前后的啟動子序列導入報告質粒，轉化到野生珠C7258及CRP缺失株WL7258中比較冷光值的差異�；魜y弧菌中mtl基因簇調控甘露醇發(fā)酵的結構基因是mtlCBA，檢測不同年代與不同地區(qū)的菌株，對24株甘露醇快發(fā)酵菌株和24株甘露醇慢發(fā)酵菌株在甘露醇發(fā)酵液中提取RNA，選取3個時間點（0.5h，2h，4h）檢測mtlCBA基因轉錄，用Real-time熒光定量PCR的方法，比較兩類菌株中甘露醇操縱子mtA，mtlD基因轉錄水平在培養(yǎng)發(fā)酵液過程中RNA的差異。另外，利用WB（western）實驗技術，提取總蛋白，觀察兩類菌株mtlD基因在甘露醇發(fā)酵液中的蛋白表達差異。 結果改造前報告質粒在野生株中的冷光值高于CRP缺失株，改造后報告質粒的冷光值在兩株菌中均有升高，但在野生株中的升高值更為明顯。試驗中隨機挑選24株甘露醇慢發(fā)酵株和24株甘露醇快發(fā)酵株，檢測這兩種類型的菌株在甘露醇發(fā)酵試驗中，甘露醇操縱子mtlCBA的RNA轉錄水平的差異，，經(jīng)比較， RNA轉錄水平在早期，甘露醇快發(fā)酵株mtlCBA高于甘露醇慢發(fā)酵株；且甘露醇快速發(fā)酵株的操縱子mtlD基因蛋白表達量也高于甘露醇慢發(fā)酵株。 結論霍亂弧菌的受體蛋白CRP調控HDH的轉錄，但不是唯一調控因子，霍亂弧菌兩種菌株甘露醇PTS操縱子的轉錄差異，是啟動子活性水平流行和非流行株甘露醇發(fā)酵菌株差異的原因。
【關鍵詞】：霍亂弧菌 CRP 甘露醇 轉錄
【學位授予單位】：河北聯(lián)合大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 引言11-14
• 第1章 霍亂弧菌 CRP 的碳源利用與甘露醇轉錄差異14-42
• 1.1 材料14-20
• 1.1.1 主要儀器與試劑14-15
• 1.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件15-17
• 1.1.3 菌株與質粒17-20
• 1.2 方法20-29
• 1.2.1 CRP 結合位點預測與搭橋20-21
• 1.2.2 質粒構建21-22
• 1.2.3 感受態(tài)細胞的制備及轉化試驗22
• 1.2.4 接合轉移22
• 1.2.5 冷光值的測定22-23
• 1.2.6 核酸操作技術23-25
• 1.2.7 Total RNA 的提取25-26
• 1.2.8 Ambion，s DNA-freeTM 消除 DNA 污染26
• 1.2.9 逆轉錄試驗與 RT-PCR26-27
• 1.2.10 WB 操作試驗27-29
• 1.3 結果29-34
• 1.3.1 CRP 結合位點預測與搭橋29
• 1.3.2 質粒構建29-31
• 1.3.3 報告質粒在不同菌株中冷光值的測定31
• 1.3.4 提取 RNA 的質量31-32
• 1.3.5 菌株在甘露醇中的轉錄差異32-33
• 1.3.6 菌株在甘露醇液中的蛋白表達差異33-34
• 1.4 討論34-37
• 1.4.1 霍亂弧菌中 CRP 對高絲氨酸脫氫酶基因的調控作用34-36
• 1.4.2 霍亂弧菌甘露醇發(fā)酵 mRNA 轉錄和蛋白表達水平36-37
• 1.5 結論37-38
• 參考文獻38-42
• 第2章 綜述 霍亂弧菌 CRP 對甘露醇代謝的研究進展42-52
• 2.1 霍亂弧的基本特性42-45
• 2.1.1 霍亂弧菌流行特征與致病機制42-43
• 2.1.2 霍亂弧菌的鑒定與分型43-45
• 2.2 霍亂弧菌 CRP 對甘露醇的影響45-48
• 2.2.1 CRP 蛋白在細菌中的研究45-46
• 2.2.2 霍亂弧菌中受 CRP 調節(jié)的基因46-48
• 2.2.3 CRP 未來應用48
• 參考文獻48-52
• 致謝52-53
• 導師簡介53-54
• 作者簡介及在學成果54-56
• 學位論文數(shù)據(jù)集56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 金大智;張政;羅蕓;葉菊蓮;程蘇云;吳方;金郁;;多重熒光定量PCR甄別3種霍亂弧菌相關毒素基因[J];中國人獸共患病學報;2011年12期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張紅芝;El Tor型霍亂弧菌中甘露醇和山梨醇代謝機制研究[D];中國疾病預防控制中心;2009年

  本文關鍵詞：霍亂弧菌CRP的碳源利用與甘露醇發(fā)酵轉錄水平的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：328895