目的探討急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）小鼠肺組織中肺內(nèi)源性干細(xì)胞的表達(dá)水平。方法 10只C57BL/6小鼠分成兩組:實驗組和對照組,實驗組通過氣管內(nèi)注射脂多糖（LPS）構(gòu)建小鼠ARDS模型,采用氣管內(nèi)注射PBS作為對照組;采用膠原酶、熱消化法消化小鼠肺組織獲取小鼠肺單細(xì)胞懸液;雙重免疫熒光染色方法鑒定小鼠肺組織中sca-1+CD31-CD45-細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)對肺sca-1+CD31-CD45-細(xì)胞進(jìn)行分選。采用方差分析及獨立t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果通過氣管內(nèi)注入LPS成功制作小鼠急性ARDS模型;5只小鼠的全肺組織制備單細(xì)胞懸液總數(shù)目達(dá)5×107個/ml,活細(xì)胞百分比為98﹪;肺內(nèi)源性干細(xì)胞包括Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、clara細(xì)胞以及支氣管肺泡干細(xì)胞等,通過肺組織雙重免疫熒光染色,驗證小鼠肺組織Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、clara細(xì)胞以及支氣管肺泡干細(xì)胞;對照組及實驗組各樣本肺內(nèi)源性干細(xì)胞數(shù)目占單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)比例呈正態(tài)分布,且實驗組肺內(nèi)源性干細(xì)胞數(shù)目水平（10.73±10.65）﹪較對照組水平（12.23±0.73）﹪降低（t=-3.405,P <0.01）。結(jié)論 ARDS時,小鼠肺內(nèi)... 

【文章來源】：中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版). 2019,9(04)

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奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織

·202·中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版)2019年8月第9卷第4期ChinJCellStemCell(ElectronicEdition),Aug2019,Vol.9,No.4注：a~c圖為對照組，d~f圖為實驗組，實驗組較對照組小鼠肺組織肺泡間隔破壞較明顯，肺泡間隔見肺毛細(xì)血管、肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤及大量紅細(xì)胞；a，d圖放大40倍，b，e圖放大200倍，c，f圖放大400倍圖1奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織（HE染色）注：a圖為藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核；b圖為綠色熒光為SP-C抗體標(biāo)記，表示Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞；c圖為中紅色熒光為CAA抗體標(biāo)記，表示clara細(xì)胞；d圖為黃色熒光為SP-C、CCA雙陽性細(xì)胞，即支氣管肺泡干細(xì)胞圖2奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察肺組織（雙重免疫熒光染色，×200）

·204·中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版)2019年8月第9卷第4期ChinJCellStemCell(ElectronicEdition),Aug2019,Vol.9,No.4注：a圖為實驗組空白對照；b圖為加入CD45抗體，R2為從肺細(xì)胞中分選出除白細(xì)胞（CD45+）之外的細(xì)胞群（CD45-細(xì)胞）；c圖中R3指CD31-sca-1+細(xì)胞群，通過CD31-標(biāo)記除去血管內(nèi)皮細(xì)胞；d圖中R4指CD45+陽性細(xì)胞群圖4實驗組樣本肺內(nèi)源性干細(xì)胞（sca-1+CD31-CD45-cells）流式細(xì)胞圖染色；免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光，以此來進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。在實驗結(jié)果中，根據(jù)只加二抗的陰性對照排除背景染色及非特異性染色之外，可以看到肺組織中細(xì)胞顯示綠色熒光的為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，細(xì)胞顯示紅色熒光的為clara細(xì)胞，顯示黃色熒光的為支氣管肺泡干細(xì)胞[11-12]，因此驗證了小鼠肺組織中肺sca-1+CD31-CD45-細(xì)胞的存在，為下一步流式細(xì)胞術(shù)分選肺內(nèi)源性干細(xì)胞提供了理論基礎(chǔ)支持。關(guān)于ARDS中肺內(nèi)源性干細(xì)胞的變化鮮有報道，根據(jù)目前國內(nèi)外研究結(jié)果，其表面標(biāo)記為scal+CD31-CD45-分子較多[13]，為了得到純度較高的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行分眩實驗結(jié)果表明，ARDS小鼠肺scal+CD31-CD45-細(xì)胞占肺總細(xì)胞的比例較對照組下降。而Qian等[14]實驗中證實人肺腺癌組織中肺內(nèi)源性干細(xì)胞的數(shù)目高于癌旁組織，其具體原因及機制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。Deng等[15]在香煙提取物致肺氣腫小鼠肺sca-

【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]急性肺損傷后內(nèi)源性肺干/祖細(xì)胞的動態(tài)變化及其修復(fù)作用[D]. 李海勝.第三軍醫(yī)大學(xué) 2013



本文編號：3279880