本文關(guān)鍵詞：柯薩奇病毒B3 2A蛋白酶對(duì)NF-κB和IRF功能影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：柯薩奇病毒(Coxsachievirus),是一類腸道病毒,分為A和B兩類,此類病毒感染引起的疾病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,有無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎、心包炎、流行性胸肌痛、皰疹性咽峽炎等。其中B組3型柯薩奇病毒(Coxsachievirus B3,CVB3)是引起小兒病毒性心肌炎的重要病原體,CVB3持續(xù)感染可以導(dǎo)致慢性心肌炎和擴(kuò)張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)。目前柯薩奇病毒無(wú)特效抗病毒藥物,研究其致病機(jī)制為抗病毒治療提供思路。 CVB3病毒結(jié)構(gòu)為二十面體結(jié)構(gòu),基因組為單正鏈RNA,有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF),編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白,包括兩個(gè)蛋白酶2A和3C。與其他腸道病毒相似,CVB3蛋白酶2A和3C被認(rèn)為是病毒復(fù)制所必需的。已有研究證實(shí)CVB3編碼的蛋白酶是DCM發(fā)生的重要致病因素,其中心臟表達(dá)蛋白酶2A的轉(zhuǎn)基因小鼠可發(fā)展為重度心臟功能障礙和DCM,提示2A蛋白酶可能在CVB3病毒感染過(guò)程中參與誘導(dǎo)宿主細(xì)胞損傷,但其確切機(jī)制尚不明確。 CVB32A蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶,具有多種生物學(xué)活性。2A蛋白酶不僅參與切割病毒多聚蛋白,而且促進(jìn)病毒多聚核糖體的形成及穩(wěn)定；還能通過(guò)切割翻譯起始因子eIF4G I抑制細(xì)胞帽樣結(jié)構(gòu)依賴蛋白翻譯；CVB32A還可以切割細(xì)胞骨架蛋白肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白,提示與DCM有關(guān)；除此以外,2A蛋白酶能干擾宿主細(xì)胞防御系統(tǒng),在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。 病毒感染后,宿主免疫反應(yīng)的第一道防線是先天性免疫系統(tǒng),在病毒感染細(xì)胞數(shù)分鐘內(nèi)就可以產(chǎn)生逐漸增強(qiáng)的抗病毒反應(yīng)。RNA病毒感染后,病毒RNA復(fù)制時(shí)雙鏈RNA中間體及單鏈RNA基因組能夠被模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)識(shí)別,PRR是位于宿主細(xì)胞膜或胞質(zhì)中的一類受體蛋白,能識(shí)別特殊病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),進(jìn)而激活自分泌和旁分泌天然免疫信號(hào),觸發(fā)先天性免疫系統(tǒng),細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒因子干擾素(Interferon, IFN)。當(dāng)細(xì)胞被病毒感染或者受各種因素刺激時(shí),核因子-KB(Nuclear factor-KB, NF-κB)和干擾素(IFN)信號(hào)通路被激活,啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放,引起機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)。 為探討CVB3的蛋白酶2A對(duì)NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor, IRF)功能的影響,首先構(gòu)建CVB3病毒的2A蛋白酶表達(dá)載體pcDNA3.1-CVB3-2A,將此表達(dá)載體與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)基因啟動(dòng)了熒光素酶報(bào)告基因載體NF-KB-Luc-pGL3載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)TNF α刺激,檢測(cè)熒光素酶活性；轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1-CVB3-2A后,經(jīng)TNF α刺激,通過(guò)免疫熒光和Western Blot檢測(cè)CVB32A蛋白酶對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄因了NF-κB核定位和二聚體形成的影響。結(jié)果顯示,CVB32A可以減少轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65表達(dá)、二聚體形成,并干擾轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)移。本研究證實(shí)CVB3的蛋白酶2A可通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄因子的二聚體形成和核轉(zhuǎn)錄而干擾細(xì)胞因子的分泌。將此表達(dá)載體與干擾素(IFN)基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體IFN-Luc-pGL3載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)poly(I:C)刺激,檢測(cè)熒光素酶活性；轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1-CVB3-2A后,經(jīng)poly(I:C)刺激,通過(guò)Western Blot檢測(cè)CVB32A蛋白酶對(duì)IRF3/7細(xì)胞核漿分布的影響。本研究證實(shí)CVB3的蛋白酶2A可通過(guò)干擾IRF的表達(dá)和核漿分布而影響IFN信號(hào)通路。 同時(shí),為了解CVB32A蛋白酶功能的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ),通過(guò)分析,CVB32A蛋白酶內(nèi)部具有3個(gè)核定位信號(hào)分別為aal3-18RVVNRH、aa65-70KNKHYP和aa88-93PRRYQSH,2A C端有一段酸性結(jié)構(gòu)域aa133-147DIRDLLWLEDDAMEQ.針對(duì)這些可能的功能區(qū)域,構(gòu)建缺失突變體的真核表達(dá)載體,分別命名為pcDNA3.1-CVB3-2A-1、pcDNA3.1-CVB3-2A-2、pcDNA3.1-CVB3-2A-3和pcDNA3.1-CVB3-2A-C。轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)區(qū)域的缺失不同程度的影響了2A的功能。2A-1、2A-3和2A-C缺失突變體的2A蛋白使得其對(duì)eIF4G I的切割功能缺失,而2A-2還保留eIF4G I的切割功能,提示2A-1、2A-3和2A-C缺失的區(qū)域是2A蛋白酶發(fā)揮切割eIF4G I功能的重要區(qū)域。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)2A-2缺失突變體對(duì)NF-κB p65、IRF7的表達(dá),以及NF-κB和干擾素啟動(dòng)子的功能均具有較強(qiáng)的抑制作用,而2A-1、2A-2、2A-3和2A-C缺失突變體對(duì)NF-κB p65、IRF7的表達(dá),以及NF-κB和干擾素啟動(dòng)子的功能影響較小。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 引言11-14
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法14-28
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-45
• 討論45-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 綜述53-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 縮略詞對(duì)照表63-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷65-67
• 致謝67-68
• 附錄68

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 付銀;�；菔|;劉靜;陳慧勇;;口蹄疫病毒與宿主細(xì)胞的相互作用研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2013年11期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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8 王寶棟;EMCV 3C蛋白酶抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2014年

9 張利杰;腦心肌炎病毒3C蛋白切割TANK解除其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制作用[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

10 付銀;干擾素γ對(duì)口蹄疫病毒抑制作用的初步研究[D];中南大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：柯薩奇病毒B3 2A蛋白酶對(duì)NF-κB和IRF功能影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：327257