發(fā)布時(shí)間：2017-04-25 22:14

  本文關(guān)鍵詞：胱氨酸的氧化作用對(duì)人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（Receptor Activator of Nuclear Factor-κ BLigand, RANKL）是RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)中的一個(gè)II型跨膜受體蛋白，主要表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的表面。RANKL與其受體RANK以六聚體的形式結(jié)合并將信號(hào)傳遞至NF-κB,最終促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與成熟。RANKL在破骨細(xì)胞增殖、分化、活化、存活以及腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列生理過(guò)程中起著十分重要的作用。本文表達(dá)純化人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域蛋白，并研究氧自由基對(duì)RANKL胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的影響進(jìn)而調(diào)節(jié)RANK/RANKL信號(hào)通路。 本研究將人RANKL基因與原核表達(dá)載體pET-21b連接并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E．coli Rosetta,構(gòu)建了人RANKL基因的重組體Rosetta/pET-21b-RANKL，誘導(dǎo)使其表達(dá)目的蛋白，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)OD_(600)=0.6時(shí),加入IPTG的終濃度為0.2mM,在20℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6h時(shí)，甘油濃度為4%時(shí)，可在上清中獲得較多的RANKL胞外結(jié)構(gòu)域蛋白，為該蛋白的進(jìn)一步純化及結(jié)構(gòu)與功能研究打下了基礎(chǔ)。在最佳表達(dá)條件下得到人重組RANKL胞外結(jié)構(gòu)域蛋白的粗提液，使用Ni親和層析柱進(jìn)行分離純化，經(jīng)過(guò)10mM、40mM、125mM、250mM咪唑洗脫，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)40mM咪唑洗脫，，得到電泳純蛋白。蛋白質(zhì)印跡（western blot）證明了所得的蛋白為RANKL胞外結(jié)構(gòu)域。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析并結(jié)合分子模建表明：RANKL胞外C端結(jié)構(gòu)域(141-317號(hào)氨基酸)176個(gè)氨基酸，其中含有1個(gè)半胱氨酸，在空間位置上，半胱氨酸位于表面，存在被氧化的可能。通過(guò)采用內(nèi)源熒光光譜法、ANS熒光光譜法、圓二色光譜法及SEC分子篩排阻層析法等方法，檢測(cè)胱氨酸氧化作用對(duì)人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變化。研究結(jié)果表明，氧化作用導(dǎo)致了RANKL構(gòu)象變化，并影響其多聚體的形成。提出了“氧化作用影響RANKL的多聚體進(jìn)而影響六聚體的形成，從而最終影響RANKL/RANK信號(hào)通路”的假設(shè)。氧化作用引起蛋白結(jié)構(gòu)變化的同時(shí)伴隨其功能的改變，從而影響聚合體的形成。但具體的機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的研究以期能夠?yàn)镽ANK/RANKL信號(hào)通路藥物靶向位點(diǎn)、小分子拮抗物篩選等方面提供新的證據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：RANKL胞外結(jié)構(gòu)域 原核表達(dá) 氧化 聚合體 構(gòu)象變化
【學(xué)位授予單位】：湖北師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-8
• 目錄8-10
• 第一章 引言10-17
• 1.1 RANKL 簡(jiǎn)介10-12
• 1.2 OPG/RANKL／RANK 系統(tǒng)12-13
• 1.3 RANKL 的研究狀況及應(yīng)用前景13-15
• 1.4 本論文研究工作15-17
• 第二章 人 RANKL 胞外結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)17-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器17-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.1.2 儀器設(shè)備17-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-27
• 2.2.1 人 RANKL 基因模板的確定18
• 2.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備18
• 2.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成18-19
• 2.2.4 質(zhì)粒提取19-20
• 2.2.5 PCR 擴(kuò)增與回收、酶連20-23
• 2.2.6 轉(zhuǎn)化23
• 2.2.7 重組載體的確認(rèn)23-24
• 2.2.8 人 RANKL 基因重組表達(dá)菌株的構(gòu)建24
• 2.2.9 重組菌株的原核誘導(dǎo)表達(dá)24-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-32
• 2.3.1 RANKL 基因目的片段的擴(kuò)增27
• 2.3.2 pET-21b-RANKL 表達(dá)載體 PCR 和酶切檢測(cè)27-28
• 2.3.3 重組載體的測(cè)序28-29
• 2.3.4 重組菌株的原核誘導(dǎo)表達(dá)29
• 2.3.5 重組菌株原核表達(dá)條件的優(yōu)化29-32
• 2.4 討論32-35
• 2.4.1 表達(dá)載體的選擇及重組蛋白的表達(dá)形式32-33
• 2.4.2 RANKL 蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化33-34
• 2.4.3 人 RANKL 基因原核表達(dá)研究展望34-35
• 第三章 胱氨酸對(duì)人 RANKL 胞外結(jié)構(gòu)域蛋白構(gòu)象的研究35-49
• 3.1 引言35-36
• 3.1.1 研究的基礎(chǔ)35
• 3.1.2 研究的意義35-36
• 3.1.3 氧化劑的選擇36
• 3.2 儀器設(shè)備及實(shí)驗(yàn)材料36-38
• 3.2.1 主要儀器設(shè)備36-37
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑37-38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 3.3.1 重組人 RANKL 蛋白的純化38-39
• 3.3.2 蛋白質(zhì)印跡（western blot）鑒定重組人 RANKL 胞外結(jié)構(gòu)域39-40
• 3.3.3 蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算40
• 3.3.4 光譜學(xué)檢測(cè)氧化作用對(duì)重組人 RANKL 胞外結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)變化40-42
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-47
• 3.4.1 RANKL 鎳親和層析純化42-43
• 3.4.2 蛋白質(zhì)印跡鑒定重組人 RANKL 胞外結(jié)構(gòu)域43
• 3.4.3 重組體人 RANKL 胞外結(jié)構(gòu)域蛋白的光譜學(xué)檢測(cè)43-47
• 3.5 討論47-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 附錄1 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄56

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：胱氨酸的氧化作用對(duì)人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：327195