本文關(guān)鍵詞：基于EGFR二聚化靶向策略的多肽疫苗構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是EGFR家族的主要成員之一，在眾多上皮源惡性腫瘤細胞表面過表達，是抗腫瘤藥物的熱門靶點。目前已有針對EGFR的單抗與小分子酪氨酸激酶抑制劑類藥物上市，但此類藥物臨床反應(yīng)率低（15-25%），其背后主要原因是EGFR分子表面及酪氨酸激酶區(qū)域具有高度變異性。又配體結(jié)合引起的EGFR之間或EGFR與其他家族成員間的“二聚化”是EGFR下游信號通路激活的關(guān)鍵步驟，參與“二聚化”的界面區(qū)是結(jié)構(gòu)上高度保守的區(qū)域，因此靶向EGFR二聚體界面區(qū)有可能提高抗EGFR類治療的臨床反應(yīng)率。治療性疫苗屬于主動免疫，給藥劑量小，僅需少數(shù)幾次免疫接種，因此，比抗體類產(chǎn)品更具順應(yīng)性。惡性腫瘤治療性多肽疫苗以腫瘤抗原肽為活性組分，可利用基因工程或化學合成手段低成本生產(chǎn)，具有較好的產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。本實驗室前期工作中分離鑒定了一個來自EGFR的B細胞表位肽——EGFR237-267，基于該B細胞表位肽與一種來自麻疹病毒融合蛋白的Th表位肽MVF所構(gòu)建的“嵌合肽”，可有效刺激體液免疫反應(yīng)，并在體內(nèi)外呈現(xiàn)了一定的抗瘤活性，但此類抗原肽的免疫原性尚有改進空間。P64K是一種來自腦膜炎球菌外膜蛋白的新型載體蛋白，免疫原性強、安全性高、并且可通過基因工程方法高效生產(chǎn)，便于質(zhì)控。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，構(gòu)建一系列基于EGFR237-267和P64K及MVF的B細胞表位多肽疫苗，，并通過免疫原性和體內(nèi)抗瘤活性比較試驗篩選、并確定抗原肽最佳構(gòu)建形式，以便為研制靶向EGFR二聚體界面的多肽疫苗打下基礎(chǔ)。 方法： 1.重組抗原MVF-E的制備 將MVF-E質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)中表達，產(chǎn)物加入EDTA及PMSF抑制內(nèi)源性蛋白酶降解，經(jīng)陰離子交換層析除去降解蛋白，鎳離子螯合親和層析純化融合蛋白，腸激酶酶切獲得小子分抗原肽。 2.化學偶聯(lián)抗原P64K*E與P64K*MVF-E的制備 大腸桿菌表達系統(tǒng)中誘導表達P64K蛋白，通過Q柱、Source30Q、PEI離子交換柱純化蛋白，獲得純度為90%以上的載體蛋白。B細胞表位E通過化學合成獲得，MVF-E通過方法1獲得，將載體蛋白與B細胞表位E以及MVF-E用PBS溶解后，按兩者摩爾比比例1:10混合，加戊二醛終濃度0.5%反應(yīng)，反應(yīng)時間45min，以0.2mol甘氨酸終止反應(yīng)，獲得偶聯(lián)產(chǎn)物，Sephadex G-25除去小分子物質(zhì)，樣品凍干備用。 3.重組抗原P64K-E與E-P64K的制備 獲得P64K-E與E-P64K質(zhì)粒，導入大腸桿菌表達系統(tǒng)，以鎳離子螯合親和層析純化融合蛋白。 4.五種構(gòu)建形式的抗原肽的免疫原性分析 將60只C57BL/6小鼠隨機分成6組，Ⅰ組：佐劑對照組；Ⅱ組：MVF-E組；Ⅲ組：P64K*E組；Ⅳ組：P64K*MVF-E組；Ⅴ組：P64K-E組；Ⅵ組：E-P64K組，初次免疫后每隔兩周加強免疫，每次免疫后10天取血，ELISA法檢測小鼠血清效價。 5.體內(nèi)抑瘤活性分析 建立C57BL/6小鼠肺癌模型（LLC）,于小鼠免疫第三次后14天背肩胛部皮下移植腫瘤，觀察小鼠腫瘤成瘤情況、生長情況及身體狀況，移植腫瘤7天后每隔兩天用游標卡尺測量小鼠的腫瘤體積大小，21天后剝離小鼠腫瘤，稱重，分析每組疫苗抑瘤情況及小鼠肺轉(zhuǎn)移情況。 結(jié)果 1.成功制備五種構(gòu)建形式MVF-E、P64K*E、P64K*MVF-E、P64K-E和E-P64K的多肽疫苗。 2.五種多肽疫苗均在小鼠身上產(chǎn)生較高滴度的抗體，其中化學偶聯(lián)形式P64K*E產(chǎn)生的滴度最高，其結(jié)果優(yōu)于融合肽的抗體滴度。而以融合肽形式表達的多肽抗原中，抗體滴度MVF-E＞E-P64K＞P64K-E。 3.比較各組小鼠腫瘤抑制情況，P64K*E、P64K-E和E-P64K組與對照組的腫瘤抑制情況相比具有統(tǒng)計學差異，其中P64K*E組的抑瘤情況最明顯。MVF-E與P64K*MVF-E組的抑瘤情況不明顯。各組小鼠在21天時均未出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移情況。 結(jié)論 確定了基于B細胞表位EGFR237-267的抗原肽最佳構(gòu)建形式為P64K*E，為進一步研制相關(guān)疫苗打下了良好基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：多肽疫苗 靶向二聚化界面 化學偶聯(lián) 抗腫瘤
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 第1章 緒論12-18
• 1 前言12
• 2 目前針對 EGFR 過表達惡性腫瘤的靶向治療及存在的缺陷12-13
• 3 “二聚化靶向”策略13-14
• 4 主動免疫發(fā)展概況14-17
• 5 本課題的研究基礎(chǔ)及內(nèi)容17-18
• 第2章 EGFR 二聚化靶向多肽疫苗的設(shè)計與制備18-46
• 1 前言18-19
• 2 實驗材料19-23
• 2.1 基因模板來源19
• 2.2 菌種和質(zhì)粒19
• 2.3 引物序列19
• 2.4 主要試劑19-20
• 2.5 主要儀器設(shè)備20-21
• 2.6 溶液的配制21-23
• 3 實驗方法23-30
• 3.1 重組抗原 MVF-E 的制備23-24
• 3.1.1 MVF-E 基因的獲得23
• 3.1.2 MVF-E 蛋白誘導表達23-24
• 3.1.3 MVF-E 表達產(chǎn)物純化24
• 3.2 化學偶聯(lián)抗原 P64K*E 與 P64K*MVF-E 的制備24-29
• 3.2.1 多肽片段 E 與 MVF-E 的獲得24
• 3.2.2 基因工程方法制備 P64k 載體24-28
• 3.2.3 戊二醛法制備偶聯(lián)抗原 P64K*E 與 P64K*MVF-E28-29
• 3.3 重組抗原 P64K-E 與 E-P64K 的制備29-30
• 3.3.1 重組蛋白誘導表達29
• 3.3.2 鎳柱親和層析純化重組蛋白29-30
• 4 實驗結(jié)果30-43
• 4.1 抗原肽設(shè)計30-32
• 4.1.1 重組抗原肽的構(gòu)建30
• 4.1.2 偶聯(lián)抗原肽的構(gòu)建30-32
• 4.2 重組抗原 MVF-E 的制備與鑒定32-36
• 4.2.1 MVF-E 的原核構(gòu)建表達形式構(gòu)建32-33
• 4.2.2 MVF-E 的表達形式分析33
• 4.2.3 MVF-E 表達產(chǎn)物的分離純化與鑒定33-36
• 4.3 化學偶聯(lián)抗原 P64K*E 與 P64K*MVF-E 的制備36-42
• 4.3.1 PCR 擴增目的基因 P64K 及其鑒定36-37
• 4.3.2 重組 P64K 蛋白表達形式分析37-38
• 4.3.3 P64K 蛋白純度及收率38-39
• 4.3.4 偶聯(lián)抗原 P64K*E 與 P64K*MVF-E39-42
• 4.4 重組抗原 P64K-E 與 E-P64K 的獲得42-43
• 5 討論43-45
• 6 小結(jié)45-46
• 第3章 抗原肽的免疫原性分析及體內(nèi)抑瘤活性分析46-61
• 1 前言46
• 2 實驗材料46-49
• 2.1 細胞株46
• 2.2 實驗動物46-47
• 2.3 主要試劑設(shè)備47
• 2.4 主要試劑的配制47-49
• 3 實驗方法49-52
• 3.1 分組與給藥49
• 3.2 LLC 肺癌皮下移植瘤模型建立49-50
• 3.3 抗原表位肽免疫原性分析50-51
• 3.3.1 小鼠血清的采集50
• 3.3.2 ELISA 檢測小鼠血清中的抗體滴度50-51
• 3.4 觀察指標51
• 3.4.1 成瘤率及生存情況51
• 3.4.2 腫瘤生長情況51
• 3.4.3 腫瘤瘤重及抑瘤率51
• 3.4.4 肺轉(zhuǎn)移節(jié)節(jié)點數(shù)及主要免疫臟器的影響51
• 3.5 統(tǒng)計學分析51-52
• 4 實驗結(jié)果52-58
• 4.1 免疫原性分析52-53
• 4.2 致瘤結(jié)果53-54
• 4.3 各組小鼠生存質(zhì)量54-55
• 4.4 腫瘤體積及生長曲線55-56
• 4.5 腫瘤的瘤重及抑瘤率56-58
• 4.6 小鼠肺轉(zhuǎn)移情況58
• 5 討論58-60
• 6 小結(jié)60-61
• 第4章 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-68
• 攻讀碩士學位期間所發(fā)表的論文專利及科研成果68-69
• 附錄1 文獻綜述69-78
• 參考文獻74-78
• 附錄2 英文縮寫詞表78-80
• 附錄3 核酸及氨基酸序列80-86
• 致謝86

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 何穎,張尚權(quán),趙峰,吳振華,王耀發(fā),嚴緣昌;表皮生長因子受體單抗導向藥物(EQ75-ADR)的制備及對人表皮癌抑瘤作用的研究[J];中國腫瘤生物治療雜志;2000年02期

  本文關(guān)鍵詞：基于EGFR二聚化靶向策略的多肽疫苗構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：325020