本文關(guān)鍵詞：抑制新型布尼亞病毒感染化合物的篩選及其作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：2009年我國(guó)發(fā)現(xiàn)了一種新型布尼亞病毒，該病毒能引起發(fā)熱和血小板減少等癥狀因此被命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）。SFTSV屬于布尼亞病毒科，白蛉病毒屬的分段負(fù)義RNA病毒，該病毒導(dǎo)致的人類(lèi)嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征。目前對(duì)其侵染細(xì)胞的具體機(jī)制尚不明確，臨床上亦無(wú)有效的治療方法。了解病毒的感染過(guò)程是有效預(yù)防和治療疾病的基礎(chǔ)，本文以篩選抑制SFTSV感染的化合物作為切入點(diǎn)，通過(guò)研究受體酪氨酸激酶（RTKs）與SFTSV感染之間的關(guān)系，探究SFTSV的感染機(jī)制。 本研究中，我們首先以免疫熒光染色和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）為檢測(cè)手段描述了SFTSV在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中的復(fù)制及釋放情況，并篩選出2種對(duì)感染有明顯抑制作用的化合物，由于這兩種化合物是受體酪氨酸激酶或其下游PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路中的抑制劑，因此我們利用磷酸化RTKs array分析了SFTSV感染后細(xì)胞RTKs磷酸化水平的變化情況，并設(shè)計(jì)了小干擾RNA（siRNA）定向沉默某些RTKs的基因，研究SFTSV感染與RTKs之間的關(guān)系，以期對(duì)研究SFTSV感染宿主細(xì)胞的機(jī)制有所啟示。通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)，感染SFTSV的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上并無(wú)太大變化，細(xì)胞中病毒含量隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)呈典型的“S型”曲線增長(zhǎng)，而在培養(yǎng)上清中病毒以“波浪式”增長(zhǎng)的方式持續(xù)上升至很高的滴度，這與臨床報(bào)告中患者伴有高病毒血癥的事實(shí)相符。研究還發(fā)現(xiàn)，化合物BEZ235和Sunitinib能抑制SFTSV感染，且與病毒同時(shí)加入或感染2小時(shí)后再加入化合物仍能有效的抑制SFTSV感染，其中BEZ235為磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）p110亞基及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的抑制劑，Sunitinib為血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β（PDGFRβ）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VRGFR）抑制劑，這一現(xiàn)象說(shuō)明SFTSV可能在進(jìn)入細(xì)胞之后的過(guò)程中利用了RTKs-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路完成自身生命活動(dòng)。之后我們對(duì)SFTSV感染后細(xì)胞RTKs磷酸化水平變化進(jìn)行RTK磷酸化array分析，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了針對(duì)不同RTKs的siRNA，發(fā)現(xiàn)在HUVEC細(xì)胞中沉默神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體1（TrkA）基因表達(dá)，SFTSV的感染受到明顯抑制，，在Hela細(xì)胞中沉默PDGFRβ基因及在cos7細(xì)胞中沉默VEGFR1基因，都能在一定程度上降低SFTSV的感染水平，而在HUVEC細(xì)胞中沉默成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（FGFR1）基因表達(dá)反而促進(jìn)SFTSV的感染。這些研究結(jié)果提示我們，SFTSV的感染可能激活了TrkA、PDGFR、VEGFR等RTKs，并通過(guò)宿主細(xì)胞的RTKs-PI3K/Akt-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路完成基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白質(zhì)合成、裝配及子代病毒的釋放等感染后期過(guò)程。 關(guān)于本文中篩選出的兩種化合物對(duì)SFTSV感染的抑制作用，在此之前并未見(jiàn)過(guò)相關(guān)報(bào)道，此外也未見(jiàn)到關(guān)于該病毒感染與RTKs之間的相關(guān)性的報(bào)道，因此本研究具有一定的創(chuàng)新性。 本研究的結(jié)果為從分子水平上研究SFTSV感染的具體過(guò)程，了解其發(fā)病機(jī)制，制定有效的預(yù)防和治療方法提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：新型布尼亞病毒 抗病毒化合物 PI3K/AKT RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目錄8-13
• 主要英文縮寫(xiě)注釋表13-15
• 第一章 緒論15-28
• 1.1 引言15
• 1.2 發(fā)熱伴血小板減少綜合癥病毒概況15-24
• 1.2.1 病毒結(jié)構(gòu)15-18
• 1.2.2 病毒生活史18-22
• 1.2.3 流行病學(xué)22-23
• 1.2.4 臨床表現(xiàn)、檢查及確診方法23
• 1.2.5 臨床治療及預(yù)防控制措施23-24
• 1.3 目前國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展24-25
• 1.4 本文涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介25-27
• 1.4.1 免疫熒光染色25-26
• 1.4.2 實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)26
• 1.4.3 RNA 干擾技術(shù)26-27
• 1.5 研究目的及意義27-28
• 第二章 SFTSV 的定量、感染及檢測(cè)28-42
• 2.1 前言28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器28-30
• 2.2.1 病毒及細(xì)胞28
• 2.2.2 主要試劑28-29
• 2.2.3 主要溶液配制29
• 2.2.4 主要儀器29-30
• 2.2.5 引物及質(zhì)粒30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法30-37
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.3.2 病毒滴度測(cè)定31-32
• 2.3.3 TRIzol 法提取總 RNA32-33
• 2.3.4 RNA 反轉(zhuǎn)錄33
• 2.3.5 實(shí)時(shí)定量 PCR33-35
• 2.3.6 免疫熒光染色35
• 2.3.7 MOI 值計(jì)算35-36
• 2.3.8 以 HUVEC 測(cè)定 SFTSV 的感染及釋放36-37
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-40
• 2.4.1 SFTSV 定量37-38
• 2.4.2 SFTSV 感染及釋放時(shí)間曲線38-40
• 2.5 討論40-42
• 第三章 抑制 SFTSV 感染化合物的篩選42-56
• 3.1 前言42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器42-46
• 3.2.1 病毒及細(xì)胞42
• 3.2.2 相關(guān)化合物介紹42-45
• 3.2.3 試劑及儀器45
• 3.2.4 主要溶液配制45-46
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法46-48
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)46
• 3.3.2 化合物抑制 SFTSV 感染實(shí)驗(yàn)46-48
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-54
• 3.4.1 化合物對(duì) Hela 細(xì)胞感染的影響48-49
• 3.4.2 化合物對(duì) RD 細(xì)胞及 HUVEC 感染的影響49-54
• 3.4.3 BEZ235 和 Sunitinib 對(duì)感染后細(xì)胞的保護(hù)作用54
• 3.5 討論54-56
• 第四章 感染對(duì)受體酪氨酸磷酸酶磷酸化水平的影響56-63
• 4.1 前言56-58
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器58-59
• 4.2.1 病毒及細(xì)胞58
• 4.2.2 試劑與儀器58
• 4.2.3 主要溶液配制58-59
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)59
• 4.3.2 RTKs 磷酸化水平陣列分析59-61
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-62
• 4.5 討論62-63
• 第五章 利用小干擾 RNA 研究 SFTSV 的感染機(jī)制63-75
• 5.1 前言63
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器63-64
• 5.2.1 病毒及細(xì)胞63
• 5.2.2 試劑與儀器63-64
• 5.2.3 主要溶液配制64
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法64-69
• 5.3.1 siRNA 及 qRT-PCR 檢測(cè)引物設(shè)計(jì)64-66
• 5.3.2 檢測(cè)不同細(xì)胞系中目的基因的表達(dá)情況66-67
• 5.3.3 siRNA 轉(zhuǎn)染67
• 5.3.4 siRNA 干擾效率檢測(cè)67-68
• 5.3.5 RTKs 表達(dá)水平降低對(duì) SFTSV 感染的影響68-69
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-73
• 5.4.1 不同細(xì)胞系中 RTKs 的表達(dá)情況69-70
• 5.4.2 siRNA 沉默目的基因效率70-71
• 5.4.3 RTKs 基因沉默對(duì) SFTSV 感染的影響71-73
• 5.5 討論73-75
• 全文總結(jié)75-77
• 參考文獻(xiàn)77-80
• 致謝80

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 奚國(guó)良,顧坤健,張鴻良,林子森;

本文編號(hào)：324047