本文關鍵詞：應用特異性免疫磁珠快速檢測單增李斯特菌，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：研制單增李斯特菌特異性免疫磁珠，結合免疫磁珠富集技術與選擇性平板培養(yǎng)法，初步建立免疫磁珠-選擇性平板快速檢測方案，對單增李斯特菌進行分離及鑒定。同時，利用免疫磁珠富集技術進行樣品前處理，聯(lián)合環(huán)介導等溫擴增技術，建立一種快速檢測單增李斯特菌的新方法。 方法：利用分泌單增李斯特菌單克隆抗體的雜交瘤細胞（1B10A7），制備并純化腹水型單抗；選擇三種表面官能團不同的磁珠制備特異性免疫磁珠；通過比較免疫磁珠捕菌率高低挑選合適磁珠，建立免疫磁珠-選擇性培養(yǎng)基檢測方法；通過特異性分析、靈敏度分析及牛奶樣品檢測評價該方法的檢測效果。隨后，以單增李斯特菌毒力基因hly和prfA為模板設計環(huán)介導等溫擴增引物，經(jīng)陽性篩選、交叉菌篩選及熒光定量PCR挑選最佳引物，PCR擴增產物經(jīng)分子克隆后測序鑒定；建立免疫磁珠-環(huán)介導等溫擴增檢測方法，通過靈敏度分析和牛奶樣品檢測對該方法進行評價。 結果：制備了效價為6×10~4的腹水型單抗，單抗偶聯(lián)磁珠后，選擇捕菌率最佳的Dynal甲苯磺�；罨胖檫M行后續(xù)試驗；特異性免疫磁珠聯(lián)合選擇性平板法可檢出濃度為103CFU/mL及以上的單增李斯特菌，僅與英諾克李斯特菌存在交叉反應；牛奶樣品單次僅需6h增菌能被檢出，較常規(guī)增菌時間縮短42h；檢測限為0.7CFU/mL。經(jīng)篩選獲得一組prfA基因高特異性且擴增效率最高的引物對，擴增產物經(jīng)測序鑒定與靶序列吻合；免疫磁珠-環(huán)介導等溫擴增檢測方法檢測靈敏度為10~1CFU/mL，對牛奶樣品的檢測限為1CFU/mL。 結論：聯(lián)合使用免疫磁珠富集技術與選擇性培養(yǎng)基，能在30h內完成對牛奶樣品的檢測，較國標法減少42h以上，且具有同等的靈敏度。免疫磁珠-環(huán)介導等溫擴增檢測方法具有高特異性、高靈敏度及快速檢測的優(yōu)勢，在不進行預增菌的情況下對含菌量較低的陽性樣品亦可檢出。本研究結合免疫磁珠富集技術，初步建立了單增李斯特菌快速檢測方法，通過進一步的條件摸索及優(yōu)化，日后有望應用到食品安全監(jiān)測工作中。
【關鍵詞】：免疫磁珠 富集 單克隆抗體 單增李斯特菌 環(huán)介導等溫擴增技術 檢測限
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R446.6;R378.994
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 前言8-21
• 1 免疫磁珠分離技術8-11
• 1.1 免疫磁珠的結構8-9
• 1.2 免疫磁珠富集作用原理9
• 1.3 免疫磁珠富集優(yōu)勢9-11
• 1.4 免疫磁珠富集技術在食源性致病菌檢測中的應用11
• 2 單增李斯特菌的概述11-14
• 2.1 單增李斯特菌的生物學特征及血清型分類11-12
• 2.2 單增李斯特菌的致病機理及毒力因子12-13
• 2.3 單增李斯特菌的危害13-14
• 3 單增李斯特菌檢測方法的研究進展14-16
• 3.1 傳統(tǒng)分離及生化鑒定14-15
• 3.2 免疫學檢測15
• 3.3 分子生物學診斷15-16
• 4 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術16-19
• 4.1 LAMP 技術擴增原理及步驟16-17
• 4.2 LAMP 技術特點17-19
• 5 本研究的目的和意義19-20
• 6 技術路線圖20-21
• 第二章 單增李斯特菌 IMB-顯色培養(yǎng)基檢測方法研究21-37
• 1 材料21-25
• 1.1 主要試劑和儀器設備21-22
• 1.2 菌株22
• 1.3 實驗動物22
• 1.4 主要溶液的配制方法22-25
• 2 試驗方法25-29
• 2.1 菌株的培養(yǎng)及滅活處理25
• 2.2 單增李斯特菌腹水型單抗的制備及純化25-27
• 2.3 單增李斯特菌免疫磁珠的制備27-28
• 2.4 IMB-選擇性培養(yǎng)基檢測方法的建立28-29
• 2.5 IMB-選擇性培養(yǎng)基法檢測人工污染牛奶樣品29
• 3 結果與分析29-34
• 3.1 單增李斯特菌單抗的純化及鑒定29-31
• 3.2 單增李斯特菌免疫磁珠的制備31-32
• 3.3 IMB-選擇性培養(yǎng)基檢測方法的建立32-33
• 3.4 IMB-選擇性培養(yǎng)基法檢測人工污染牛奶樣品33-34
• 4 討論34-37
• 第三章 單增李斯特菌 IMB-LAMP 檢測方法研究37-51
• 1 材料37-39
• 1.1 主要試劑和儀器設備37-38
• 1.2 菌株38
• 1.3 主要溶液的配制方法38-39
• 2 試驗方法39-44
• 2.1 菌株的培養(yǎng)39
• 2.2 細菌 DNA 的提取39-40
• 2.3 單增李斯特菌特異性 LAMP 引物的設計40-43
• 2.4 IMB-LAMP 方法的建立43
• 2.5 IMB-LAMP 方法檢測牛奶樣品43-44
• 3 結果與分析44-49
• 3.1 單增李斯特菌特異性 LAMP 引物的篩選及鑒定44-47
• 3.2 免疫磁珠捕菌率的鑒定47
• 3.3 IMB-LAMP 靈敏度的測定47-48
• 3.4 IMB-LAMP 方法檢測人工污染牛奶樣品48-49
• 4 討論49-51
• 第四章 結論與展望51-52
• 參考文獻52-58
• 在校期間發(fā)表論文和學術交流情況58-60
• 致謝60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 徐金亭;李志清;向軍儉;唐勇;楊紅宇;;單增李斯特菌免疫磁珠的制備研究[J];食品工業(yè)科技;2012年05期

2 張加林;楊林嫻;;單增李斯特菌的食源性污染狀況及檢測方法[J];醫(yī)學理論與實踐;2012年08期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張亞爽;LAMP和PCR檢測單核細胞增生性李斯特氏菌的研究[D];河北農業(yè)大學;2008年

2 李志清;單增李斯特菌特異性的膜表面蛋白的抗體的制備[D];暨南大學;2012年

  本文關鍵詞：應用特異性免疫磁珠快速檢測單增李斯特菌，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：323709