本文關鍵詞：UGT1A1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：分別構(gòu)建尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT1A1）基因野生型、G71R純合突變型重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染于COS-7細胞，并檢測UGT1A1的表達，為后續(xù)研究UGT1A1基因突變表達提供工具、奠定實驗基礎。 方法： （1）利用基因重組技術(shù)分別克隆人UGT1A1野生型、G71R（211G→A）純合突變型基因作為目的基因，將目的基因與pIRES2-EGFP載體質(zhì)粒分別雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR和基因測序分析，從而判斷重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。 （2）設立UGT1A1野生型轉(zhuǎn)染組、G71R純合突變型轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組四組，，利用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染于COS-7細胞，轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。 （3）利用實時熒光定量PCR（RT-PCR）、免疫印跡（Western blot）分別檢測UGT1A1在COS-7細胞中的mRNA水平和蛋白水平的表達。 結(jié)果： （1）PCR擴增UGT1A1野生型、G71R純合突變型目的基因，瓊脂糖凝膠電泳獲得約1622bp大小的目的基因片段。 （2）重組質(zhì)粒進行基因測序鑒定，顯示UGT1A1野生型重組質(zhì)粒結(jié)果與UGT1A1mRNA（NM_000463）的堿基序列完全相同，同源性為100%，G71R純合突變型重組質(zhì)粒與UGT1A1mRNA（NM_000463）的堿基序列僅相差1個堿基（211G→A），與預期點突變結(jié)果完全一致，同源性為99%。 （3）重組質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時后的COS-7細胞在熒光顯微鏡下可見顯著綠色熒光標記，轉(zhuǎn)染效率約為40%；未轉(zhuǎn)染組的COS-7細胞未見綠色熒光標記。 （4）野生型轉(zhuǎn)染組和突變型轉(zhuǎn)染組COS-7細胞UGT1A1的mRNA和蛋白相對表達量顯著高于空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）；空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組間無明顯差異（P＞0.05）。 結(jié)論： （1）UGT1A1基因野生型、G71R純合突變型重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 （2）轉(zhuǎn)染了UGT1A1基因野生型、G71R純合突變型重組質(zhì)粒的COS-7細胞能夠表達UGT1A1。
【關鍵詞】：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1 G71R純合突變 重組質(zhì)粒 COS-7細胞
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中英文縮略語4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-30
• 1. 實驗材料11-15
• 2. 實驗方法15-30
• 結(jié)果30-42
• 討論42-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-56
• 綜述56-74
• 參考文獻64-74
• 致謝74-75
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳霞;何念海;;表達UGT1 A1重組腺相關病毒載體的構(gòu)建[J];重慶醫(yī)學;2006年21期

2 鐘丹妮;劉義;林偉雄;;膽紅素—尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因突變類型對廣西新生兒高膽紅素血癥發(fā)病的影響[J];廣西醫(yī)科大學學報;2008年06期

3 鐘丹妮,劉義,黎漢忠,龍盛京,劉悠南;肝臟膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖苷酰轉(zhuǎn)移酶的生后發(fā)育[J];廣西醫(yī)科大學學報;1997年03期

4 鐘丹妮,劉義,黎漢忠,龍盛京,劉悠南;人類肝臟膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)前發(fā)育[J];廣西醫(yī)科大學學報;1998年01期

5 劉玲;胡敏;畢之琪;張路;蔣榆輝;李楊方;;云南省重癥新生兒黃疸與Gly71Arg基因多態(tài)性研究[J];昆明醫(yī)科大學學報;2012年07期

6 鐘勇;蔣曉梅;馮于玲;吳曉靜;鐘丹妮;;UGT1A1基因多態(tài)性與不同民族間新生兒高膽紅素血癥的關系[J];臨床兒科雜志;2013年04期

7 田桂英;徐放生;朱鳳霞;藍常肇;韓穎;;新生兒遷延性黃疸與尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因突變的關系[J];實用兒科臨床雜志;2008年02期

8 黃瑛;;新生兒病理性黃疸對機體的損害及其防治研究進展[J];實用兒科臨床雜志;2011年02期

9 沈健;吳建新;李定國;;1例中國Gilbert綜合征家系UGT1A1基因遺傳分析[J];胃腸病學;2007年07期

10 楊琳;丁俊杰;周文浩;;UGT1A1基因多態(tài)性與新生兒黃疸遺傳關聯(lián)性的Meta分析[J];中國循證兒科雜志;2010年05期

  本文關鍵詞：UGT1A1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：323562