近十年來,G-桿菌耐藥問題日益嚴重,突出表現在耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌（大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌等）、非發(fā)酵糖細菌（鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌等）,其中肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌耐藥最為嚴重,臨床治療困難。產NDM-1超級細菌首先在印度新德里發(fā)現,主要見于大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌等腸桿菌科細菌,對臨床常用的大多數抗生素包括碳青霉烯類抗生素耐藥,可廣泛傳播,已經引起全世界的廣泛關注和高度重視。產NDM-1超級細菌對臨床大多數抗生素耐藥,治療困難,而且其臨床表現與敏感菌沒有明顯差異,臨床診斷困難,臨床上對碳青霉烯治療無效的陰性菌感染需要考慮這類細菌感染可能。目前產NDM-1超級細菌的實驗室檢查主要分三步,該方法存在周期長、操作復雜、準確性不高等缺點。因此,迫切需要建立產NDM-1超級細菌的早期、快速、準確的診斷方法。本論文旨在應用高靈敏度、高分辨率、高精確度的蛋白質譜檢測技術（Nano UPLC Orbitrap）和生物信息分析系統,在現有耐藥菌診斷技術和方法基礎上,建立產NDM-1超級細菌感染的早期、快速、準確的... 

【文章來源】：北京協和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數】：215 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
第一部分 基于LC-MS/MS技術的超級細菌耐藥酶NDM-1的檢測及降解抗生素特性研究
    中文摘要
    Abstract
    縮略語表
    第1章 前言
        1 抗生素耐藥現狀
        2 細菌耐藥酶診斷技術研究現狀
        3 液質聯用技術在蛋白質研究中的應用
    4 本課題研究目的和內容
    第2章 重組細菌耐藥酶的表達純化
        1 實驗材料
            1.1 菌株
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 試劑和藥品
            1.4 緩沖液
            1.5 儀器設備
        2 實驗方法
            2.1 NDM-1蛋白的誘導表達
            2.2 細菌菌體收集及超聲破碎
            2.3 純化目的蛋白
            2.4 蛋白樣品的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
            2.5 對蛋白膠進行考馬斯亮藍快速染色
            2.6 蛋白濃度測定
            2.7 其他重組細菌耐藥酶的表達、純化
        3 結果
            3.1 目的蛋白誘導表達及純化
            3.2 蛋白濃度測定
        4 討論
        5 小結
    第3章 重組細菌耐藥酶的LC-MS/MS檢測
        1 實驗材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 耗材
            1.3 主要儀器
        2 實驗方法
            2.1 重組蛋白PAGE膠制備
            2.2 蛋白酶解條件的建立
            2.3 LC-MS/MS分析條件
            2.4 數據處理
        3 結果
            3.1 LC-MS/MS分析
            3.2 Mascot檢索
        4 討論
            4.1 蛋白酶解
            4.2 LC-MS/MS分析條件
            4.3 Mascot檢索
        5 小結
    第4章 肺炎克雷伯桿菌中NDM-1的LC-MS/MS檢測
        1 實驗材料
            1.1 菌株
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 試劑和藥品
            1.4 溶液制備
            1.5 儀器設備
        2 實驗方法
            2.1 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146的培養(yǎng)
            2.2 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146裂解液的制備
            2 .3 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146裂解液蛋白電泳
            2.4 蛋白濃度測定
            2.5 蛋白酶解
            2.6 LC-MS/MS分析
            2.7 數據處理
        3 結果
            3.1 SDS-PAGE電泳
            3.2 蛋白濃度
            3.3 LC-MS/MS分析
            3.4 Mascot檢索
        4 討論
        5 小結
    第5章 基于LC-MS/MS的感染動物血清中NDM-1的檢測
        1 實驗材料
            1.1 菌株
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 實驗動物
            1.4 試劑和藥品
            1.5 儀器設備
        2 實驗方法
            2.1 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146的培養(yǎng)
            2.2 全身感染動物模型的建立
            2.3 感染血清預處理
            2.4 血清高豐度蛋白去除
            2.5 SDS-PAGE電泳
            2.6 蛋白酶解
            2.7 LC-MS/MS分析
            2.8 實驗室三步法驗證
            2.9 數據處理
        3 結果
            3.1 SDS-PAGE電泳
            3.2 LC-MS/MS分析結果
            3.4 實驗室三步法驗證
        4 討論
        5 小結
    第6章 NDM-1對β-內酰胺類抗生素降解特性研究
        1 實驗材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 耗材
            1.3 主要儀器
        2 實驗方法
            2.1 LC-MS/MS分析條件
            2.2 確定各底物最佳測定波長
            2.3 抗生素對NDM-1的穩(wěn)定性測試
            2.4 NDM-1的酶動力學
        3 結果
            3.1 各底物最佳吸收波長
            3.2 抗生素對NDM-1的穩(wěn)定性試驗
            3.3 NDM-1的酶動力學特征
        4 討論
            4.1 LC-MS/MS分析條件
            4.2 抗生素對NDM-1的穩(wěn)定性
            4.3 NDM-1的酶動力學特性
        5 小結
    第7章 討論與結論
        1 討論
        2 結論
    參考文獻
第二部分 新型抗結核候選物YH-8的臨床前藥代動力學研究
    中文摘要
    Abstract
    縮略語表
    第1章 前言
        1 結核病現狀
        2 抗結核藥物研發(fā)現狀
        3 液-質聯用技術及其在藥物研究中的應用
        4 本課題研究目的和內容
    第2章 生物樣品中YH-8的LC-MS/MS分析方法的確立
        1 實驗材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 實驗動物
            1.3 耗材
            1.4 主要儀器
        2 生物樣品預處理
            2.1 溶液的配制
            2.2 生物樣品的預處理
        3 LC-MS/MS分析條件
            3.1 色譜條件
            3.2 質譜條件
        4 分析方法確證
            4.1 特異性
            4.2 標準曲線及線性范圍
            4.3 靈敏度
            4.4 精密度和準確性
            4.5 提取回收率
            4.6 基質效應
            4.7 穩(wěn)定性
        5 分析方法的實施
        6 結果
            6.1 特異性
            6.2 標準曲線、線性范圍和靈敏度
            6.3 精密度和準確性
            6.4 提取回收率和基質效應
            6.5 穩(wěn)定性
        7 討論
            7.1 樣品的前處理
            7.2 色譜條件
            7.3 質譜條件
        8 小結
    第3章 YH-8在大鼠體內的藥代動力學研究
        1 實驗材料
        2 實驗方法
            2.1 YH-8藥液的配制
            2.2 動物飼養(yǎng)及給藥
            2.3 血樣采集
            2.4 樣品處理與分析
        3 結果
            3.1 血藥濃度
            3.2 藥時曲線
            3.3 藥代動力學參數
        4 討論
            4.1 給藥劑量
            4.2 藥物動力學
        5 小結
    第4章 YH-8在大鼠體內的組織分布研究
        1 實驗材料
        2 實驗方法
            2.1 YH-8藥液的配制
            2.2 動物飼養(yǎng)及給藥
            2.3 大鼠給藥方案和藥品采集
            2.4 樣品處理與分析
        3 結果
            3.1 色譜行為
            3.2 大鼠的組織樣品標準曲線繪制
            3.3 組織藥物濃度
        4 討論
            4.1 檢測方法適用性
            4.2 藥物的組織分布
        5 小結
    第5章 YH-8的生物轉化研究
        1 實驗材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 混合人肝微粒體和cDNA重組表達的人源P450微粒體
            1.3 實驗動物
            1.4 耗材
            1.5 主要儀器
        2 實驗方法
            2.1 肝臟體外代謝
            2.2 動物實驗
            2.3 LC-MS/MS分析條件
        3 結果
            3.1 肝臟體外代謝結果
            3.2 大鼠體內實驗結果
        4 討論
            4.1 人肝微粒體體系
            4.2 代謝酶亞型確定
            4.3 代謝產物鑒定
            4.4 基本代謝途徑
        5 小結
    第6章 YH-8代謝酶抑制研究
        1 實驗材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 耗材
            1.3 儀器
            1.4 溶液的配制
        2 實驗方法
            2.1 CYP3A4的酶抑制研究
            2.2 CYP2C9的酶抑制研究
            2.3 CYP2C19的酶抑制研究
            2.4 CYP2D6的酶抑制研究
            2.5 CYP1A2的酶活性研究
            2.6 數據處理
        3 結果
        4 討論
            4.1 CYP450重組酶亞型的選擇
            4.2 孵育體系
            4.3 YH-8的酶抑制評價
        5 小結
    第7章 討論與結論
        1 討論
        2 結論
    參考文獻
總結與展望
文獻綜述
    參考文獻
個人簡歷、在校期間發(fā)表的學術文章
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌耐藥分析及耐藥酶的檢測探討[J]. 陳巧榮.  中外醫(yī)療. 2012(12)
[2]兒童產超廣譜β-內酰胺酶菌株感染危險因素分析[J]. 劉建華,劉新鋒,帥金鳳,武芳,胡皓夫.  中國當代兒科雜志. 2011(12)
[3]135株鼠傷寒沙門菌耐藥酶檢測及藥物敏感性分析[J]. 郭寶俊,曹小燕,何昱葦.  中華醫(yī)院感染學雜志. 2011(20)
[4]小兒下呼吸道感染病原菌產超廣譜β-內酰胺酶的檢測分析[J]. 楊善浦,董虹.  中華醫(yī)院感染學雜志. 2010(23)
[5]P450酶的研究進展[J]. 崔穎,張永旺.  中國新技術新產品. 2009(16)
[6]醫(yī)院感染常見耐藥菌群及耐藥酶的臨床意義[J]. 王怡云.  甘肅醫(yī)藥. 2008(06)
[7]燈盞細辛注射液對小鼠肝微粒體細胞色素P450含量的影響[J]. 許黎君,居文政,陳為烤,談恒山.  中國臨床藥理學與治療學. 2008(10)
[8]液相色譜-串聯質譜法對植物源性食品中4種吡啶類除草劑殘留量的測定[J]. 陳波,靳保輝,謝麗琪,沈金燦.  分析測試學報. 2008(10)
[9]藥物代謝轉化和樣品前處理技術的研究進展[J]. 孔琦,張振清.  國際藥學研究雜志. 2008(02)
[10]適用于LC-MS的三聚氰胺檢測新方法[J]. 馮薇,王伯初,米鵬程,雷宇,周提軍,杜慧娟,王兵.  廣東農業(yè)科學. 2008(04)

碩士論文
[1]高效液相色譜—質譜法在中成藥分析中的應用研究[D]. 許海棠.廣西大學 2008



本文編號：3232133