近十年來(lái),G-桿菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重,突出表現(xiàn)在耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌（大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等）、非發(fā)酵糖細(xì)菌（鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等）,其中肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌耐藥最為嚴(yán)重,臨床治療困難。產(chǎn)NDM-1超級(jí)細(xì)菌首先在印度新德里發(fā)現(xiàn),主要見(jiàn)于大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等腸桿菌科細(xì)菌,對(duì)臨床常用的大多數(shù)抗生素包括碳青霉烯類抗生素耐藥,可廣泛傳播,已經(jīng)引起全世界的廣泛關(guān)注和高度重視。產(chǎn)NDM-1超級(jí)細(xì)菌對(duì)臨床大多數(shù)抗生素耐藥,治療困難,而且其臨床表現(xiàn)與敏感菌沒(méi)有明顯差異,臨床診斷困難,臨床上對(duì)碳青霉烯治療無(wú)效的陰性菌感染需要考慮這類細(xì)菌感染可能。目前產(chǎn)NDM-1超級(jí)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室檢查主要分三步,該方法存在周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、準(zhǔn)確性不高等缺點(diǎn)。因此,迫切需要建立產(chǎn)NDM-1超級(jí)細(xì)菌的早期、快速、準(zhǔn)確的診斷方法。本論文旨在應(yīng)用高靈敏度、高分辨率、高精確度的蛋白質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)（Nano UPLC Orbitrap）和生物信息分析系統(tǒng),在現(xiàn)有耐藥菌診斷技術(shù)和方法基礎(chǔ)上,建立產(chǎn)NDM-1超級(jí)細(xì)菌感染的早期、快速、準(zhǔn)確的... 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：215 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
第一部分 基于LC-MS/MS技術(shù)的超級(jí)細(xì)菌耐藥酶NDM-1的檢測(cè)及降解抗生素特性研究
    中文摘要
    Abstract
    縮略語(yǔ)表
    第1章 前言
        1 抗生素耐藥現(xiàn)狀
        2 細(xì)菌耐藥酶診斷技術(shù)研究現(xiàn)狀
        3 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用
    4 本課題研究目的和內(nèi)容
    第2章 重組細(xì)菌耐藥酶的表達(dá)純化
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 菌株
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 試劑和藥品
            1.4 緩沖液
            1.5 儀器設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 NDM-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2 細(xì)菌菌體收集及超聲破碎
            2.3 純化目的蛋白
            2.4 蛋白樣品的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
            2.5 對(duì)蛋白膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)快速染色
            2.6 蛋白濃度測(cè)定
            2.7 其他重組細(xì)菌耐藥酶的表達(dá)、純化
        3 結(jié)果
            3.1 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
            3.2 蛋白濃度測(cè)定
        4 討論
        5 小結(jié)
    第3章 重組細(xì)菌耐藥酶的LC-MS/MS檢測(cè)
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 耗材
            1.3 主要儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 重組蛋白PAGE膠制備
            2.2 蛋白酶解條件的建立
            2.3 LC-MS/MS分析條件
            2.4 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 LC-MS/MS分析
            3.2 Mascot檢索
        4 討論
            4.1 蛋白酶解
            4.2 LC-MS/MS分析條件
            4.3 Mascot檢索
        5 小結(jié)
    第4章 肺炎克雷伯桿菌中NDM-1的LC-MS/MS檢測(cè)
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 菌株
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 試劑和藥品
            1.4 溶液制備
            1.5 儀器設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146的培養(yǎng)
            2.2 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146裂解液的制備
            2 .3 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146裂解液蛋白電泳
            2.4 蛋白濃度測(cè)定
            2.5 蛋白酶解
            2.6 LC-MS/MS分析
            2.7 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 SDS-PAGE電泳
            3.2 蛋白濃度
            3.3 LC-MS/MS分析
            3.4 Mascot檢索
        4 討論
        5 小結(jié)
    第5章 基于LC-MS/MS的感染動(dòng)物血清中NDM-1的檢測(cè)
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 菌株
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.4 試劑和藥品
            1.5 儀器設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 肺炎克雷伯桿菌ATCC BAA2146的培養(yǎng)
            2.2 全身感染動(dòng)物模型的建立
            2.3 感染血清預(yù)處理
            2.4 血清高豐度蛋白去除
            2.5 SDS-PAGE電泳
            2.6 蛋白酶解
            2.7 LC-MS/MS分析
            2.8 實(shí)驗(yàn)室三步法驗(yàn)證
            2.9 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 SDS-PAGE電泳
            3.2 LC-MS/MS分析結(jié)果
            3.4 實(shí)驗(yàn)室三步法驗(yàn)證
        4 討論
        5 小結(jié)
    第6章 NDM-1對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素降解特性研究
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 耗材
            1.3 主要儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 LC-MS/MS分析條件
            2.2 確定各底物最佳測(cè)定波長(zhǎng)
            2.3 抗生素對(duì)NDM-1的穩(wěn)定性測(cè)試
            2.4 NDM-1的酶動(dòng)力學(xué)
        3 結(jié)果
            3.1 各底物最佳吸收波長(zhǎng)
            3.2 抗生素對(duì)NDM-1的穩(wěn)定性試驗(yàn)
            3.3 NDM-1的酶動(dòng)力學(xué)特征
        4 討論
            4.1 LC-MS/MS分析條件
            4.2 抗生素對(duì)NDM-1的穩(wěn)定性
            4.3 NDM-1的酶動(dòng)力學(xué)特性
        5 小結(jié)
    第7章 討論與結(jié)論
        1 討論
        2 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 新型抗結(jié)核候選物YH-8的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究
    中文摘要
    Abstract
    縮略語(yǔ)表
    第1章 前言
        1 結(jié)核病現(xiàn)狀
        2 抗結(jié)核藥物研發(fā)現(xiàn)狀
        3 液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及其在藥物研究中的應(yīng)用
        4 本課題研究目的和內(nèi)容
    第2章 生物樣品中YH-8的LC-MS/MS分析方法的確立
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.3 耗材
            1.4 主要儀器
        2 生物樣品預(yù)處理
            2.1 溶液的配制
            2.2 生物樣品的預(yù)處理
        3 LC-MS/MS分析條件
            3.1 色譜條件
            3.2 質(zhì)譜條件
        4 分析方法確證
            4.1 特異性
            4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍
            4.3 靈敏度
            4.4 精密度和準(zhǔn)確性
            4.5 提取回收率
            4.6 基質(zhì)效應(yīng)
            4.7 穩(wěn)定性
        5 分析方法的實(shí)施
        6 結(jié)果
            6.1 特異性
            6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和靈敏度
            6.3 精密度和準(zhǔn)確性
            6.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)
            6.5 穩(wěn)定性
        7 討論
            7.1 樣品的前處理
            7.2 色譜條件
            7.3 質(zhì)譜條件
        8 小結(jié)
    第3章 YH-8在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 YH-8藥液的配制
            2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)及給藥
            2.3 血樣采集
            2.4 樣品處理與分析
        3 結(jié)果
            3.1 血藥濃度
            3.2 藥時(shí)曲線
            3.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)
        4 討論
            4.1 給藥劑量
            4.2 藥物動(dòng)力學(xué)
        5 小結(jié)
    第4章 YH-8在大鼠體內(nèi)的組織分布研究
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 YH-8藥液的配制
            2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)及給藥
            2.3 大鼠給藥方案和藥品采集
            2.4 樣品處理與分析
        3 結(jié)果
            3.1 色譜行為
            3.2 大鼠的組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
            3.3 組織藥物濃度
        4 討論
            4.1 檢測(cè)方法適用性
            4.2 藥物的組織分布
        5 小結(jié)
    第5章 YH-8的生物轉(zhuǎn)化研究
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 混合人肝微粒體和cDNA重組表達(dá)的人源P450微粒體
            1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.4 耗材
            1.5 主要儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 肝臟體外代謝
            2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
            2.3 LC-MS/MS分析條件
        3 結(jié)果
            3.1 肝臟體外代謝結(jié)果
            3.2 大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論
            4.1 人肝微粒體體系
            4.2 代謝酶亞型確定
            4.3 代謝產(chǎn)物鑒定
            4.4 基本代謝途徑
        5 小結(jié)
    第6章 YH-8代謝酶抑制研究
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 藥品與試劑
            1.2 耗材
            1.3 儀器
            1.4 溶液的配制
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 CYP3A4的酶抑制研究
            2.2 CYP2C9的酶抑制研究
            2.3 CYP2C19的酶抑制研究
            2.4 CYP2D6的酶抑制研究
            2.5 CYP1A2的酶活性研究
            2.6 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
        4 討論
            4.1 CYP450重組酶亞型的選擇
            4.2 孵育體系
            4.3 YH-8的酶抑制評(píng)價(jià)
        5 小結(jié)
    第7章 討論與結(jié)論
        1 討論
        2 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
總結(jié)與展望
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)文章
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)菌耐藥分析及耐藥酶的檢測(cè)探討[J]. 陳巧榮.  中外醫(yī)療. 2012(12)
[2]兒童產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株感染危險(xiǎn)因素分析[J]. 劉建華,劉新鋒,帥金鳳,武芳,胡皓夫.  中國(guó)當(dāng)代兒科雜志. 2011(12)
[3]135株鼠傷寒沙門菌耐藥酶檢測(cè)及藥物敏感性分析[J]. 郭寶俊,曹小燕,何昱葦.  中華醫(yī)院感染學(xué)雜志. 2011(20)
[4]小兒下呼吸道感染病原菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)分析[J]. 楊善浦,董虹.  中華醫(yī)院感染學(xué)雜志. 2010(23)
[5]P450酶的研究進(jìn)展[J]. 崔穎,張永旺.  中國(guó)新技術(shù)新產(chǎn)品. 2009(16)
[6]醫(yī)院感染常見(jiàn)耐藥菌群及耐藥酶的臨床意義[J]. 王怡云.  甘肅醫(yī)藥. 2008(06)
[7]燈盞細(xì)辛注射液對(duì)小鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450含量的影響[J]. 許黎君,居文政,陳為烤,談恒山.  中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué). 2008(10)
[8]液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)植物源性食品中4種吡啶類除草劑殘留量的測(cè)定[J]. 陳波,靳保輝,謝麗琪,沈金燦.  分析測(cè)試學(xué)報(bào). 2008(10)
[9]藥物代謝轉(zhuǎn)化和樣品前處理技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 孔琦,張振清.  國(guó)際藥學(xué)研究雜志. 2008(02)
[10]適用于LC-MS的三聚氰胺檢測(cè)新方法[J]. 馮薇,王伯初,米鵬程,雷宇,周提軍,杜慧娟,王兵.  廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(04)

碩士論文
[1]高效液相色譜—質(zhì)譜法在中成藥分析中的應(yīng)用研究[D]. 許海棠.廣西大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3232133