本文關(guān)鍵詞：沙門氏菌外膜蛋白的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：沙門氏菌屬于腸桿菌科，是可引起人畜共患病的革蘭氏陰性桿菌。沙門氏菌外膜蛋白可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，協(xié)助細(xì)菌具有耐藥性，并作為毒力因子在細(xì)菌的致病過程中發(fā)揮重要作用。本論文通過對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌四種外膜蛋白基因btuB、mipA、nmpC和pagC的分布進(jìn)行了初步研究并對(duì)編碼的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC的免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，此外對(duì)mipA基因在鼠傷寒沙門氏菌中的功能進(jìn)行了探究。 一、btuB、mipA、nmpC和pagC四種基因在腸道細(xì)菌中的研究。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到四個(gè)具有強(qiáng)免疫原性的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC，編碼四種蛋白的基因分別為btuB、mipA、nmpC和pagC。應(yīng)用PCR基因擴(kuò)增技術(shù)，檢測(cè)上述四種基因在141株腸道細(xì)菌中的分布情況。結(jié)果顯示在大腸埃希氏菌和志賀氏菌未攜帶nmpC和pagC基因，部分沙門氏菌株攜帶這兩種基因，值得注意的是與甲型副傷寒沙門氏菌不同，傷寒沙門氏菌不具有nmpC基因。上述結(jié)果為傷寒類疾病的臨床診斷及新疫苗研發(fā)提供了參考。 二、BtuB、NmpC和PagC外膜蛋白免疫原性的研究。利用陰離子交換法及固化金屬離子親和層析方法對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌的外膜蛋白NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC進(jìn)行純化，獲得純度大于90%的目的蛋白。首先， NmpC和PagC蛋白分別與鋁佐劑及殼聚糖結(jié)合后，免疫小鼠后檢測(cè)抗體，結(jié)果顯示鋁佐劑結(jié)合組的抗體滴度與殼聚糖結(jié)合組并無顯著差異；其次，通過與鋁佐劑結(jié)合，his-BtuB、his-NmpC,和his-PagC聯(lián)合免疫小鼠后，，發(fā)現(xiàn)IgG抗體滴度差異顯著；最后， NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC分別與鋁佐劑結(jié)合后免疫小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，組氨酸標(biāo)簽具有一定的免疫原性，帶標(biāo)簽免疫組的抗體滴度與無標(biāo)簽免疫組差異顯著。 三、鼠傷寒沙門氏菌mipA基因功能的研究。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建mipA同源突變盒，結(jié)合λ-Red噬菌體重組系統(tǒng)，將卡那基因替代鼠傷寒沙門氏菌基因組mipA基因，成功構(gòu)建了50013△mipA::kan缺失株，50013mipAH互補(bǔ)株,50333△mipA::kan缺失株,50333mipAH互補(bǔ)株。通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)及生理生化鑒定，結(jié)果顯示mipA缺失并不影響細(xì)菌的表型和生理生化特性；通過毒力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mipA基因缺失后50013△mipA::kan缺失株侵襲能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于50013野生株和50013mipAH互補(bǔ)株，mipA過表達(dá)株50013mipAH侵襲能力較50013野生株減弱，本實(shí)驗(yàn)證明了mipA在鼠傷寒沙門氏菌的侵襲方面發(fā)揮著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：甲型副傷寒沙門氏菌 外膜蛋白 免疫原性 鼠傷寒沙門氏菌 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.22
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 縮略語(yǔ)索引7-8
• 第一章 前言8-11
• 1.1 外膜蛋白的組成、結(jié)構(gòu)及功能8
• 1.2 沙門氏菌外膜蛋白在細(xì)菌致病中的作用8-9
• 1.2.1 沙門氏菌外膜蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡8-9
• 1.2.2 沙門氏菌外膜蛋白作為毒力因子9
• 1.3 沙門氏菌外膜蛋白在細(xì)菌耐藥性中的作用9
• 1.4 沙門氏外膜蛋白的免疫學(xué)特性9-10
• 1.5 展望10
• 1.6 本研究的目的意義10-11
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與儀器11-17
• 2.1 材料與試劑11-13
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒11
• 2.1.2 主要試劑11-13
• 2.2 培養(yǎng)基及主要溶液的配制13-16
• 2.3 主要儀器16
• 2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16-17
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法17-36
• 3.1 實(shí)驗(yàn)步驟17-19
• 3.1.1 細(xì)菌基因組 DNA 小量提取17
• 3.1.2 質(zhì)粒小量提取17-18
• 3.1.3 DNA 凝膠回收18
• 3.1.4 質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)18-19
• 3.2 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 基因在腸道細(xì)菌中的存在狀況19-20
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)19
• 3.2.2 nmpC、pagC、btuB 和 mipA 目的基因的擴(kuò)增19-20
• 3.3 甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白的免疫原性研究20-25
• 3.3.1 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)20
• 3.3.2 Western Blot 鑒定重組蛋白20-21
• 3.3.3 目的蛋白的純化21
• 3.3.4 BCA 法測(cè)定蛋白濃度21-22
• 3.3.5 殼聚糖和鋁佐劑對(duì)外膜蛋白免疫原性的影響22-23
• 3.3.6 his 標(biāo)簽對(duì)外膜蛋白免疫原性的影響23-24
• 3.3.7 多個(gè)外膜蛋白聯(lián)合的免疫原性24
• 3.3.8 總 IgG 抗體的測(cè)定24-25
• 3.4 鼠傷寒沙門氏菌 mipA 基因功能的研究25-36
• 3.4.1 鼠傷寒沙門氏菌菌株鑒定25-26
• 3.4.2 mipA 突變株及互補(bǔ)株的構(gòu)建26-33
• 3.4.3 野生株、基因缺失株和互補(bǔ)株毒力相關(guān)性研究33-36
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-64
• 4.1 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 基因在腸道細(xì)菌中的存在狀況36-44
• 4.1.1 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 基因序列測(cè)定36
• 4.1.2 btuB 基因分布結(jié)果36-37
• 4.1.3 mipA 基因分布結(jié)果37-39
• 4.1.4 nmpC 基因分布結(jié)果39-41
• 4.1.5 pagC 基因分布結(jié)果41-42
• 4.1.6 結(jié)果與討論42-43
• 4.1.7 小結(jié)43-44
• 4.2 甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白的免疫原性研究44-52
• 4.2.1 蛋白表達(dá)形式的確定44-45
• 4.2.2 Western Blot 鑒定結(jié)果45
• 4.2.3 NmpC、PagC、his-NmpC 和 his-PagC 蛋白的純化45-48
• 4.2.4 IgG 抗體滴度檢測(cè)48-50
• 4.2.5 結(jié)果與討論50-51
• 4.2.6 小結(jié)51-52
• 4.3 鼠傷寒沙門氏菌 mipA 功能的研究52-64
• 4.3.1 鼠傷寒沙門氏菌菌株的鑒定52-54
• 4.3.2 mipA 突變株和互補(bǔ)株的構(gòu)建54-56
• 4.3.3 突變株 PCR 鑒定56-57
• 4.3.4 野生株、突變株和互補(bǔ)株的鑒定57-59
• 4.3.5 半數(shù)致死量及競(jìng)爭(zhēng)指數(shù)結(jié)果59-61
• 4.3.6 結(jié)果與討論61-62
• 4.3.7 小結(jié)62-64
• 第五章 結(jié)語(yǔ)64-66
• 致謝66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 綜述73-83
• 參考文獻(xiàn)78-83
• 附錄 1 16SrDNA 序列比對(duì)結(jié)果83-86
• 附錄 2 btuB、mipA、pagC 和 nmpC 序列比對(duì)結(jié)果86-88
• 附錄 3 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 外膜蛋白基因在腸道細(xì)菌中的存在圖注88-91
• 附錄 4 btuB、mipA、pagC 和 nmpC 基因所用腸道細(xì)菌菌株詳細(xì)信息91-94

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 魚艷榮,劉希成,張彥明,王晶鈺;革蘭氏陰性菌外膜蛋白研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2000年02期

2 劉建忠;敖敬;田為宇;馬季驊;;基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展[J];化學(xué)與生物工程;2006年02期

3 王冠宇;梁立敏;夏民杰;;以減毒鼠傷寒沙門菌為載體的口服疫苗研究進(jìn)展[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2010年09期

4 袁盛凌;王們;劉向昕;王艷春;展德文;張兆山;;利用λ-Red重組系統(tǒng)和平衡致死系統(tǒng)改造抗藥性致腹瀉工程疫苗[J];微生物學(xué)通報(bào);2006年02期

5 王宏衛(wèi),趙平,張珉,朱詩(shī)應(yīng),戚中田;鼠傷寒沙門菌pagC啟動(dòng)子的克隆與活性分析[J];微生物學(xué)報(bào);2003年03期

6 何萍;呂鳳林;任建敏;何鳳慈;;鋁佐劑機(jī)制及其納米化前景[J];世界華人消化雜志;2003年11期

7 趙鳳蘭;李付廣;胡軍;;鼠傷寒桿菌外膜蛋白免疫原性初步研究[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1993年03期

8 胡X,史兆興,賽道建,黃留玉;Red重組系統(tǒng)及在微生物基因敲除中的應(yīng)用[J];遺傳;2003年05期

9 劉維紅;郭愛珍;徐引弟;賈愛卿;嚴(yán)克霞;陳煥春;;鼠傷寒沙門菌外膜蛋白與耐藥性關(guān)系的分析[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2007年01期

10 肖永紅,王其南,彭明利;傷寒桿菌耐喹諾酮類機(jī)理研究[J];中國(guó)抗生素雜志;2000年06期

  本文關(guān)鍵詞：沙門氏菌外膜蛋白的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：322552