發(fā)布時(shí)間：2017-04-21 14:08

  本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一類較原始的干細(xì)胞,具有高度增殖性和多向分化潛能。目前研究較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞近幾年才被人們重視并加以研究。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有相似的增殖特性及多向分化潛能,而且具有取材方便、來源廣泛、免疫原性更低等優(yōu)勢,這是其成為近年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。本研究建立了分離純化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell, hUC-MSC)的方法,并對其表面標(biāo)志進(jìn)行了鑒定。同時(shí)研究間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,并探討其分化過程中miRNA-27a和miRNA-143的表達(dá),為闡述間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路,并有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。 研究方法：在嚴(yán)格無菌條件下,采集健康足月胎兒的臍帶組織,采用酶消化法和組織塊貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng),通過流式細(xì)胞儀對其表面標(biāo)記進(jìn)行檢測。將原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),并將第5代間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)IBMX、胰島素、吲哚美辛和地塞米松聯(lián)合使用進(jìn)行脂向誘導(dǎo)。利用油紅O免疫組化染色的方法鑒定分化后的細(xì)胞,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中miRNA-27a和miRNA-143以及它們靶基因的表達(dá)。隨后分析miRNA-27a和miRNA-143以及它們對應(yīng)靶基因的變化趨勢。 研究結(jié)果：分離純化后的hUC-MSCs呈均勻有序的成纖維細(xì)胞形態(tài)。臍帶酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞2-3天可見成纖維樣細(xì)胞,3-5天后在倒置顯微鏡下可見散在分布的細(xì)胞集落,貼壁后的細(xì)胞增殖速度較快,原代細(xì)胞培養(yǎng)5天后可見大量細(xì)胞,融合度達(dá)80%。使用組織塊培養(yǎng)法,5-7天可見臍帶組織塊周圍有細(xì)胞爬出,爬出的細(xì)胞隨后貼壁生長,呈短粗梭型或多角形。貼壁后的細(xì)胞增殖速度快,2周左右細(xì)胞可達(dá)80-90%融合。兩種方法下,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%的融合度時(shí),按1：3的比例進(jìn)行傳代,傳代后細(xì)胞生長3-6小時(shí)便可貼壁,最初為短粗的梭形或者卵圓形,24小時(shí)后細(xì)胞變?yōu)殚L梭形或多邊形,細(xì)胞均勻分布,平行排列生長或旋渦狀生長,約3天可達(dá)到80%融合。取第5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物,結(jié)果顯示hUC-MSCs高表達(dá)CD44、CD73、 CD105、CD166、HLA-ABC,不表達(dá)cD34、CD106,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。在將其定向誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的過程中,利用吲哚美辛、地塞米松、胰島素以及3-異丁基-1-甲基黃嘌呤四種誘導(dǎo)劑可以使臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的效率達(dá)到90%以上,且絕大多數(shù)為油紅O染色陽性的成熟脂肪細(xì)胞。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測證實(shí)miRNA-27a在MSCs脂向分化的過程中顯著下調(diào)(0.0095±0.002vs1±0.03)；miRNA-143的相對表達(dá)量則顯著上調(diào)(17.81±0.88vs1±0.004)。 結(jié)論：該研究證實(shí)采用酶消化法和組織塊法均能分離得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,且均具有高度的增殖能力,流式細(xì)胞儀檢測符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。在體外利用吲哚美辛、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤四種誘導(dǎo)劑可以使臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化過程中,miRNA-27a和miRNA-143的相對表達(dá)量發(fā)生變化,提示miRNA-27a和miRNA-143可能參與MSCs的脂向分化過程。本研究為促進(jìn)脂肪組織工程的發(fā)展及軟組織損傷修復(fù)與重建的臨床應(yīng)用,以及為肥胖、糖尿病等代謝性疾病的診斷和治療帶來了全新的思路和視角。
【關(guān)鍵詞】：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 脂向分化 脂肪細(xì)胞 miRNA 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和純化14-23
• 1.1 對象和方法14-17
• 1.1.1 對象14
• 1.1.2 主要儀器和設(shè)備14
• 1.1.3 主要試劑及配置14-15
• 1.1.4 UC-MSCs的分離培養(yǎng)15-16
• 1.1.5 UC-MSCs的體外擴(kuò)增16
• 1.1.6 形態(tài)學(xué)觀察16-17
• 1.1.7 流式細(xì)胞儀檢測UC-MSCs的表面標(biāo)志17
• 1.2 結(jié)果17-21
• 1.2.1 UC-MSCs形態(tài)學(xué)及生長特點(diǎn)17
• 1.2.2 UC-MSCs流式細(xì)胞儀檢測17-21
• 1.3 討論21-22
• 1.3.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)21-22
• 1.3.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定22
• 1.4 小結(jié)22-23
• 二、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞23-33
• 2.1 對象和方法23-26
• 2.1.1 主要儀器和設(shè)備23
• 2.1.2 主要試劑及配置23
• 2.1.3 UC-MSCs誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞23-24
• 2.1.4 油紅O染色24
• 2.1.5 細(xì)胞RNA提取24
• 2.1.6 qRT-PCR檢測脂肪細(xì)胞中miRNA的表達(dá)24-26
• 2.2 結(jié)果26-30
• 2.2.1 成脂誘導(dǎo)及油紅O染色26
• 2.2.2 miR-27a與靶基因PPARγ在誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞中的表達(dá)變化26-27
• 2.2.3 miR-143與靶基因ERK5在誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞中的表達(dá)變化27-30
• 2.3 討論30-31
• 2.3.1 UC-MSCs誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞30
• 2.3.2 miRNA與脂肪細(xì)胞30-31
• 2.4 小結(jié)31-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明36-37
• 綜述37-51
• 綜述參考文獻(xiàn)46-51
• 致謝51

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：320496