本文關(guān)鍵詞：人臍血內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定及改良凍融法脫細胞血管支架的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血管疾病是目前全球發(fā)病率最高的疾病之一，可由動脈粥樣硬化、創(chuàng)傷、血管瘤以及各種先天性異常等因素引起，而主要治療方法與手段是血管移植術(shù)。據(jù)統(tǒng)計，在美國每年欲進行移植血管行動脈旁路術(shù)就高達10萬例以上。因此，如何進一步擴大血管移植物的有效來源已經(jīng)成為人們高度關(guān)注的重要課題。目前，血管移植物的臨床來源，主要是異體或自體血管以及人工材料，雖然這些材料可以為諸多的病患進行修復(fù)血管提供有利的條件，甚至可以更好地延長病患的生命，但是遠期效果卻未達到預(yù)期的理想程度。由于異體或是自體血管的移植分別存有組織相容性比較差，而自體動脈來源也有一定的限制等問題。而人工材料的應(yīng)用也存在著一定的問題，小口徑(內(nèi)徑小于6mm)的血管移植過程之中血管存在著不同程度的高張力、低血流的特殊狀態(tài)，在病患進行移植之后，其失敗率也較高。與此同時，這些人工血管不具備生長以及自我修復(fù)功能。 近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展與進行，組織工程學(xué)以分子生物學(xué)、生物工程學(xué)以及細胞生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)為基礎(chǔ)，通過生命科學(xué)與工程學(xué)的基本原理和方法，通過科學(xué)、有效的設(shè)計、構(gòu)造、培育以及保養(yǎng)活組織等手段，用以修復(fù)或重建病患的相關(guān)組織器官的結(jié)構(gòu)，并成為了維持或改善病患組織器官功能的邊緣科學(xué)。而通過利用該項科學(xué)技術(shù)，有效地將血管種子細胞與相應(yīng)的支架材料加以有機結(jié)合，則有希望構(gòu)建出更為理想、有效的組織工程化血管，不但具有較好的與受體組織相容性、還可以維持管腔的長期通暢率，同時還具有良好的自我修復(fù)能力以及耐久性、可塑性等優(yōu)勢特性。 組織工程血管，通常是利用細胞外基質(zhì)作為血管支架，充分、有效地運用組織工程技術(shù)，將人工培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞種植于血管支架上，再通過相關(guān)的技術(shù)手段，使之黏附、分化以及正常生長，同時分泌出ECM，從而構(gòu)建出組織相容性較為良好、無免疫原性、更具較好的持久性與可塑性，，且不易鈣化、感染、避免血栓形成的、具有生命力的血管替代物。 Herring[1]等最早地進行了相關(guān)人工血管接種血管內(nèi)皮細胞報道，經(jīng)過不斷的研究也獲得了初步成功。然而，由于構(gòu)建組織工程血管需極大數(shù)量的種子細胞，就目前來講，胚胎干細胞、脂肪干細胞髓干細胞等來源的干細胞均存有不同程度的制約因素，這也促使加強細胞自身的增殖能力，并在較短的時間之內(nèi)獲得更多的種子細胞的問題，也成為了諸多學(xué)者所關(guān)注的研究課題。盡管，組織工程種子細胞目前主要來自血管壁細胞、內(nèi)皮祖細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞以及胚胎干細胞，而內(nèi)皮祖細胞卻具有更多的優(yōu)點，從而被諸多學(xué)者認為內(nèi)皮祖細胞是構(gòu)建組織工程血管過程中的最佳種子細胞來源。 而支架材料的研究是組織工程血管的另一重要組成部分。組織工程血管要求支架必須具有良好的生物相容性、生物降解性，可以保持完整的三維立體結(jié)構(gòu)，具有一定的機械強度和血管彈性。并且在植入體內(nèi)后，不與機體發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。 本文就種子細胞的來源及自體血管支架的建立進行相關(guān)研究。旨在進一步探討和簡化內(nèi)皮祖細胞的來源，為種子細胞的大量獲取提供更多方法。而自體脫細胞血管支架的建立，為血管支架的來源提供了又一新的可能性，為血管組織工程應(yīng)用于臨床提供了新的思路和方法。 第一部分人臍血內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 研究目的： 從嬰兒新鮮臍帶血中進行內(nèi)皮祖細胞的分離，并對其進行科學(xué)的培養(yǎng)與鑒定。本文采用6%羥乙基淀粉沉降法和percoll非連續(xù)性密度梯度離心法，在新鮮人臍血中進行內(nèi)皮祖細胞（EPCs）分離，并將分離出的細胞純化，在體外進行進一步的培養(yǎng)和增殖。采用相關(guān)抗原免疫染色對所培養(yǎng)的人臍血內(nèi)皮祖細胞進行鑒定。以進一步探尋簡化的實驗步驟，如何獲得足量內(nèi)皮祖細胞的最佳實驗方法，并為實驗課題提供充足、健康的內(nèi)皮祖細胞來源，為下一步實驗準備充足的細胞來源。同時，深入探討人臍血中分離并大量培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞的可行性以及臨床應(yīng)用價值。 研究方法： 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖腹產(chǎn)手術(shù)胎兒臍帶血，無菌條件下放置于含有50U/ml肝素的血清瓶中，放置于4°C冰盒中保存，運送至細胞培養(yǎng)室，采用密度梯度離心法來獲取臍帶血單個核細胞，將獲取的單個核細胞分成兩份，加入胎牛血清M199培養(yǎng)基（FCS-M199）及自體血清M199培養(yǎng)基（AS-M199），并分別將其接種于鋪設(shè)有人纖維連接蛋白（HFN）和未鋪設(shè)有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中（標記為：F(0)、F(1)、A(0)、A(1)）進一步進行體外誘導(dǎo)、分化以及擴增。并觀察貼壁細胞在整個誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)合免疫組化、免疫熒光以及流式細胞儀等相關(guān)技術(shù)從不同角度對其進行鑒定。 研究結(jié)果： （1）培養(yǎng)1~2d后，臍血單個核細胞開始出現(xiàn)貼壁。而在3d之后紡錘形狀開始出現(xiàn)，此后貼壁細胞數(shù)量逐漸增多，且逐漸變成梭形。當(dāng)培養(yǎng)至一周時，則形成周圍為梭形細胞，而在中央是圓形細胞的典型集落。而在細胞培養(yǎng)至14d時，則出現(xiàn)了互相連接的細胞簇逐漸連接并形成網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)。與此同時，隨著培養(yǎng)時間的不斷增加，長梭形細胞也開始逐漸縮短，并呈典型鋪路石樣改變。 （2）貼壁細胞培養(yǎng)至一周之后繼續(xù)觀察，在鋪設(shè)有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)基之內(nèi)的細胞數(shù)量明顯較沒有鋪設(shè)人纖維連接蛋白的多，而在兩種不同培養(yǎng)基的細胞數(shù)量上無明顯變化。 （3）免疫組化：單個核細胞培養(yǎng)至14d之后，貼壁細胞CD31通過FCS-M199培養(yǎng)后其陽性表達率為（88.95±7.23）%；vWF的陽性表達率為（75.01±9.42）%。AS-M199培養(yǎng)的細胞其CD31陽性表達率為(86.79±7.53)%，vWF的陽性表達率為(74.31±7.14)%。 （4）免疫熒光染色：細胞培養(yǎng)至第7d，細胞吞噬DiI-acLDL（+），發(fā)出紅色熒光；結(jié)合FITC-UEA-Ⅰ（+），發(fā)出綠色熒光；雙染（+）則呈黃色熒光。FCS-M199貼壁細胞雙染陽性率（86.56±6.81）%，AS-M199的貼壁細胞雙染陽性率（84.47±7.25）%。 （5）流式細胞儀分析提示：第7天時所測定的貼壁細胞表面標志CD133、CD34以及血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2(VEGFR-2)分別為：（29.35±6.43）%、（52.79±8.01）%、（80.67±6.82）%；而在20天時的分析顯示CD133陽性率為(1.52±0.32)%，CD34以及血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2(VEGFR-2)表達率則分別為（61.48±7.65）%、（91.28±7.98）%。 研究結(jié)論： （1）通過密度梯度離心法從臍帶血分離單個核細胞，再用VEGF、bFGF等 因子誘導(dǎo)培養(yǎng)，以VEGFR-2、CD133及CD34為標志物進行檢測，可獲得較為純化的血管內(nèi)皮祖細胞。 （2）加入人纖維連接蛋白之后可以有效促進內(nèi)皮祖細胞貼壁，其細胞貼壁數(shù)量明顯多于未加入人纖維連接蛋白組。 （3）自體血清M199培養(yǎng)基（AS-M199）可替代胎牛血清M199培養(yǎng)基（FCS-M199）培養(yǎng)EPCs，并取得較佳效果。 （4）CD133在第7天時高度表達，在第20天時基本不表達，我們認為此時血管內(nèi)皮祖細胞向成熟的血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)變。因此，CD133可作為內(nèi)皮細胞與內(nèi)皮祖細胞相鑒別的重要標志。 第二部分改良凍融法脫細胞血管支架的制備 研究目的： 改良傳統(tǒng)的凍融制備脫細胞血管支架的技術(shù)，并用組織學(xué)染色和電鏡觀察等方法分別對兩種不同方法制備的血管支架進行比較。以進一步尋找更安全有效的脫細胞的方法，找到一種操作簡便、滅菌效果確實、費用低廉、殘留低的脫細胞血管支架制備方法。簡化實驗步驟，并為血管組織工程實驗提供充足、健康的血管支架來源。 研究方法： 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖腹產(chǎn)手術(shù)胎兒臍帶，無菌條件下放置于含有PBS液的血清瓶中，放置于4°C冰盒中保存，運送至細胞培養(yǎng)室，剔除臍靜脈表面的結(jié)締組織及血管外膜，PBS液清洗后，按下列3種方法制備材料：(1)傳統(tǒng)方法：放置15ml塑料凍存管內(nèi)，置4℃冰箱中預(yù)冷1小時，-80℃冰箱冷凍2h，37℃水浴復(fù)溫30min，上述凍融過程反復(fù)進行3次。(2)改良方法：放置15ml塑料凍存管內(nèi)，置4℃冰箱中預(yù)冷1小時，快速浸入-196°C液氮中20min，取出標本放入含50ml無菌蒸餾水100ml的無菌瓶內(nèi)，置于37℃的氣浴恒溫振蕩箱內(nèi)，反復(fù)振蕩，融化30min；同法進行3次，備檢測。(3)未處理：直接備檢測。 研究結(jié)果:（1）大體形態(tài)觀察：未處理組呈乳白色，管壁淡黃色，彈性良好無塌陷，管腔內(nèi)表面光滑。傳統(tǒng)反復(fù)凍融法組材料顏色淺白，管壁稍有塌陷，管腔內(nèi)表面光滑。改良反復(fù)凍融法組材料顏色淺白，管壁無明顯塌陷，管腔內(nèi)表面光滑。三者在大體形態(tài)上無明顯外觀上區(qū)別。 （2）HE染色：HE染色、觀察，未脫細胞血管壁全層細胞豐富，管腔內(nèi)面內(nèi)皮細胞呈單層排列，中層平滑肌細胞胞體細長呈極性排列。傳統(tǒng)反復(fù)凍融法處理后的血管材料內(nèi)皮細胞及中膜平滑肌細胞明顯變形，破碎；可見細胞核變形、濃染、碎裂等現(xiàn)象。改良反復(fù)凍融法處理后的血管材料管壁全層和管腔面無明顯細胞殘留。 （3）Masson三色染色法：未處理組細胞豐富，膠原纖維結(jié)構(gòu)保持完整。傳統(tǒng)反復(fù)凍融組細胞仍有部分殘留。改良反復(fù)凍融組細胞成分大部分被脫去，藍染的膠原纖維結(jié)構(gòu)保持完整。 （4）電鏡掃描結(jié)果：未處理組內(nèi)膜完整，光滑，內(nèi)皮細胞覆蓋完整。傳統(tǒng)反復(fù)凍融處理組內(nèi)皮細胞斷裂，連續(xù)性中斷；內(nèi)膜下膠原結(jié)構(gòu)保持完好。改良反復(fù)凍融法血管表面無內(nèi)皮細胞覆蓋，支架表面粗大的膠原纖維束結(jié)構(gòu)保存完好，材料結(jié)構(gòu)致密。 研究結(jié)論： 采用改良反復(fù)凍融脫細胞方法可以在較短的時間內(nèi)完全除去支架內(nèi)細胞成份，且對材料的膠原結(jié)構(gòu)無明顯影響。相對于傳統(tǒng)的反復(fù)凍融處理，改良反復(fù)凍融脫細胞血管支架為今后脫細胞血管支架的快速高效制備提供一種新的思路和方法。但關(guān)于其抗血流沖擊力及遠期通暢率等情況還需做進一步的檢測。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)皮祖細胞 分離 培養(yǎng) 鑒定 血管組織工程 脫細胞血管支架 組織工程 臍靜脈
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-17
• 第一部分 人臍血內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定17-40
• 引言17-19
• 材料與方法19-26
• 結(jié)果26-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻36-40
• 第二部分 改良凍融法脫細胞血管支架的制備40-57
• 引言40-42
• 材料與方法42-46
• 結(jié)果46-53
• 討論53-56
• 結(jié)論56-57
• 全文總結(jié)57-58
• 參考文獻58-61
• 致謝61-62
• 附錄A 縮略詞表62-63
• 附錄B 讀研期間發(fā)表論文63-64
• 附錄C 綜述一64-70
• 參 考 文 獻68-70
• 附錄C 綜述二70-83
• 參考文獻79-83

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：人臍血內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定及改良凍融法脫細胞血管支架的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：319970