本文關(guān)鍵詞：CRMP5與微管相互作用調(diào)節(jié)生長錐發(fā)育的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 探討CRMP5是否能與微管發(fā)生相互作用，以及如何影響神經(jīng)元生長錐的發(fā)育。 方法： 首先構(gòu)建CRMP5-GST原核質(zhì)粒并體外表達(dá)CRMP5融合蛋白，體外進(jìn)行pulldown實(shí)驗(yàn)，分析CRMP5在體外是否與微管相互作用；然后構(gòu)建CRMP5-FLAG及tubulin-GFP真核質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞裂解液進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn)，大鼠腦組織裂解液并提取生長錐進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn)，檢測CRMP5在體內(nèi)是否與微管結(jié)合；進(jìn)而用免疫熒光染色結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察CRMP5和tubulin在293T細(xì)胞與神經(jīng)元中的定位情況；最后將原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元過表達(dá)和敲除CRMP5基因，觀察神經(jīng)元生長錐的變化。 結(jié)果： (1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果顯示，酶切條帶大小與預(yù)期的相符，CRMP5的真核原核重組質(zhì)粒與tubulin真核重組質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)期的序列完全吻合，無突變發(fā)生； (2)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出相應(yīng)的CRMP5-GST融合蛋白，融合蛋白分子量大約90kDa，與預(yù)期大小一致； (3)用體外表達(dá)純化的CRMP5-GST融合蛋白與腦組織蛋白提取液進(jìn)行的pulldown，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CRMP5-GST融合蛋白可以成功層析出微管蛋白； (4)共同過表達(dá)CRMP-5與tubulin的293T細(xì)胞裂解液，大鼠腦組織蛋白提取液及大鼠腦組織提取的生長錐分別進(jìn)行的CoIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果同樣顯示CRMP5可以成功層析出微管蛋白； (5)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，CRMP5與tubulin共存于293T細(xì)胞的胞體和偽足，神經(jīng)元的胞體、突起和生長錐，與體內(nèi)外的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合； (6)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元敲除CRMP5基因，神經(jīng)元的生長錐發(fā)育明顯受到抑制； (7)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元過表達(dá)CRMP5基因，，可明顯促進(jìn)神經(jīng)元生長錐的發(fā)育。 結(jié)論： (1)成功構(gòu)建了CRMP5-GST、CRMP5-FLAG和tubulin-GFP原核及真核表達(dá)載體； (2)體外成功表達(dá)了CRMP5-GST融合蛋白； (3) CRMP5在體內(nèi)外均可與微管發(fā)生結(jié)合； (4) CRMP5與微管共存于293T細(xì)胞的胞體和偽足，神經(jīng)元的胞體、突起和生長錐等處； (5) CRMP5可能通過與微管相互作用參與神經(jīng)元生長錐的發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白 微管 神經(jīng)元 生長錐 相互作用
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R338
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 第一章 前言9-18
• 1.1 生長錐與神經(jīng)元的發(fā)育9-11
• 1.2. 微管與神經(jīng)元突起生長11-13
• 1.2.1 微管的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)11-12
• 1.2.2 生長錐微管運(yùn)動與突起生長12-13
• 1.3. CRMPs 家族13-16
• 1.3.1 CRMPs 的生物學(xué)特點(diǎn)13-14
• 1.3.2 CRMPs 的空間表達(dá)特征14-15
• 1.3.3 CRMPs 與神經(jīng)元突起生長的關(guān)系15-16
• 1.3.4 CRMPs 與疾病16
• 1.4. 研究目的及其意義16-18
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法18-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物18
• 2.1.2 細(xì)菌菌株、細(xì)胞株18
• 2.1.3 主要試劑、工具和試劑盒18-20
• 2.1.4 一般試劑的配制20-22
• 2.1.5 主要的儀器設(shè)備22-23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-38
• 2.2.1 RT-PCR23-24
• 2.2.2. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (RT)24-25
• 2.2.3. PCR 反應(yīng)25-26
• 2.2.4 構(gòu)建 CRMP5-GST、CRMP5-FLAG 和 Tubulin-GFP 的重組原核、真核表達(dá)載 體26-28
• 2.2.5 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)28-30
• 2.2.6 CRMP5-GST 融合蛋白與 Tubulin 的 Pulldown 分析及免疫印跡（Western Blot） 檢測30-34
• 2.2.7 CRMP5 與 tubulin 免疫熒光共定位34-35
• 2.2.8 CRMP5 與 tubulin 免疫共沉淀（coIP）分析及檢測35-37
• 2.2.9 生長錐的提取37-38
• 2.2.10 siRNA 的設(shè)計(jì)及合成38
• 2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析38-39
• 第三章 結(jié)果與分析39-49
• 3.1 構(gòu)建 Tubulin-GFP、CRMP5-FLAG 和 CRMP5-GST 的原核和真核重組表達(dá)載體39-40
• 3.2 CRMP-5-GST 融合蛋白和 tubulin GST Pulldown 分析40-42
• 3.2.1 CRMP-5-GST 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮藍(lán)染膠圖40-41
• 3.2.2 胎鼠腦組織生長錐的提取41
• 3.2.3 CRMP5 和 Tubulin 的 Pulldown 分析41-42
• 3.3 CRMP5 和 Tubulin 的 CoIP 分析42-43
• 3.4 CRMP-5 和 Tubulin 免疫熒光共定位43-45
• 3.4.1 CRMP-5 和 Tubulin 在 293T 細(xì)胞中免疫熒光共定位43-44
• 3.4.2 CRMP5 和 Tubulin 在神經(jīng)元及生長錐中免疫熒光共定位44-45
• 3.5 干擾和過表達(dá) CRMP5 對神經(jīng)元生長錐發(fā)育的影響45-49
• 3.5.1 干擾 CRMP-5 對神經(jīng)元的生長發(fā)育的影響46-47
• 3.5.2 過表達(dá) CRMP-5 對神經(jīng)元的生長發(fā)育的影響47-49
• 第四章 討論49-52
• 第五章 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 附錄：英文縮寫詞60-61
• 在讀期間發(fā)表論文61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李建農(nóng),蔣建東;微管的生物學(xué)特性與藥物研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期

  本文關(guān)鍵詞：CRMP5與微管相互作用調(diào)節(jié)生長錐發(fā)育的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：318695