本文關(guān)鍵詞：基于對(duì)蛋白質(zhì)色氨酸殘基熒光猝滅的均相親和分析方法及其應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：以蛋白質(zhì)中色氨酸或酪氨酸殘基為熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體，熒光探針作為FRET接受體可進(jìn)行均相親和分析；FRET探針需包含作為蛋白色氨酸接受體的熒光團(tuán)和蛋白特異性配體兩部分；形成復(fù)合物后激發(fā)色氨酸測(cè)定FRET效應(yīng)可確定復(fù)合物的量，從而建立對(duì)應(yīng)的均相親和分析系統(tǒng)。理論上，此法可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定非熒光配體、非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定對(duì)應(yīng)蛋白、滴定分析標(biāo)定對(duì)應(yīng)蛋白含量、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定非熒光配體親和力等。這些應(yīng)用的關(guān)鍵是獲得所需FRET探針。 本文第一部分建立了一種均相測(cè)定白蛋白（ALB）含量的熒光新方法。該法利用熒光探針8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）與白蛋白在特定條件下的高親和力結(jié)合，在280nm和350nm波長(zhǎng)激發(fā)下同時(shí)測(cè)定形成的復(fù)合物在470nm的熒光發(fā)射信號(hào)來(lái)測(cè)定血清中白蛋白的含量。ANS是白蛋白的非特異性熒光配體，親和力中等；在結(jié)合的ANS和白蛋白色氨酸殘基之間的FRET現(xiàn)象早已報(bào)道。ANS與ALB復(fù)合物有適度的量子產(chǎn)率，但ANS在緩沖水溶液中的信號(hào)可忽略，故游離ANS在280nm處激發(fā)不會(huì)造成高本底，可測(cè)定白蛋白和ANS復(fù)合物的熒光。ANS與白蛋白的結(jié)合涉及疏水和靜電相互作用，用低離子強(qiáng)度緩沖液和稍低pH值可提高ANS與白蛋白親和力。用Matlab擬合ANS滴定ALB和ALB滴定ANS曲線得到解離常數(shù)（Kd）接近0.15μM。此外，280nm激發(fā)下復(fù)合物中FRET效應(yīng)進(jìn)一步提高ANS作為生物傳感器測(cè)定白蛋白靈敏度和選擇性。通過對(duì)50例白蛋白濃度1555g/L臨床血清標(biāo)本測(cè)定，變異系數(shù)為5％以下。同時(shí)新方法對(duì)于常見的球蛋白，對(duì)潛在的干擾物青霉素和肝素，以及其他常見的干擾物質(zhì)有更好的抗干擾能力。同時(shí)結(jié)果顯示在280或350納米激發(fā)，與溴甲酚綠法（BCG）呈良好的相關(guān)性，且Bland-Altman分析證明了兩種的一致性；與免疫比濁法測(cè)定結(jié)果相關(guān)性很高，且Bland-Altman分析證明二者一致。特殊的是，280nm激發(fā)產(chǎn)生FRET效應(yīng)對(duì)應(yīng)的方法抗干擾能力、與免疫比濁法測(cè)定結(jié)果的一致性還高于BCG法。可見，利用與蛋白結(jié)合產(chǎn)物的量子產(chǎn)率增加效應(yīng)及復(fù)合物內(nèi)部的FRET效應(yīng)設(shè)計(jì)檢測(cè)特定蛋白的熒光探針，其測(cè)定的特異性和靈敏度更好。 本文第二部分建立了一種基于對(duì)單抗的色氨酸熒光淬滅作用，從頭校準(zhǔn)單克隆抗體含量的新方法。單克隆抗體（單抗）是生物分析必不可少的生物材料。在實(shí)際應(yīng)用中，單克隆抗體的含量應(yīng)準(zhǔn)確校準(zhǔn)跟蹤。六組氨酸（6His）被廣泛用于蛋白質(zhì)和融合表達(dá)及其單克隆抗體（單抗-6His）是用于檢測(cè)的6His-標(biāo)簽的目的蛋白。單抗-6His中使用的6His滴定曲線作為非熒光探針可以記錄在340nm處熒光。另一方面，丹磺酰胺是色氨酸殘基的受體，而丹磺酰的6His（DNS-6His）作為FRET探針記錄滴定曲線在540nm熒光發(fā)射或340nm熒光猝滅，單抗-6His中的滴定曲線的擬合記錄為熒光在340nm處具有任一探針遇到不收斂為單抗-6His中的量化。這兩種類型的單克隆抗體的探頭可以有足夠的純度進(jìn)行跟蹤。根據(jù)單克隆抗體激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的兩種類型的探針的滴定曲線，可以在340nm處記錄熒光，且通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的探針也可記錄探針的熒光，滴定曲線的分析可以校正結(jié)合位點(diǎn)單抗含量，從而證明這種方法是有效和普遍適用的。 本文第三部分設(shè)計(jì)合成低親和力鏈親和素?zé)晒馓结樆贔RET和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定生物素。鏈霉親和素（Streptavidin，SA）與生物素的解離常數(shù)為10-15M，親和力是抗原抗體反應(yīng)（10-5～10-11M）的1萬(wàn)倍以上。設(shè)計(jì)并合成了四種低親和力鏈親和素?zé)晒馓结槪ㄟ^聚乙二醇單甲醚（mPEG）或季胺堿陽(yáng)性離子的修飾來(lái)降低生物素（D-biotain）與SA的親和力，得到解離常數(shù)約為11nM的探針，通過探針與Bio競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SA，利用FRET效應(yīng)檢測(cè)探針與SA復(fù)合物，初步測(cè)定Bio標(biāo)準(zhǔn)曲線。此種方法獲得很好的線性響應(yīng)，，有一定應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：非競(jìng)爭(zhēng)性均相親和分析 血清白蛋白 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 單克隆抗體 鏈親和素
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-17
• 第一部分 8-苯胺-1-萘磺酸測(cè)定人血清白蛋白含量17-32
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2 ANS 測(cè)定 ALB 實(shí)驗(yàn)方法的建立17-20
• 3 結(jié)果20-31
• 4 本部分小結(jié)31-32
• 第二部分 熒光滴定法測(cè)定單抗位點(diǎn)濃度32-42
• 1 實(shí)驗(yàn)材料32-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-38
• 4 數(shù)據(jù)處理38-41
• 5 本部分小結(jié)41-42
• 第三部分 低親和力鏈親和素?zé)晒馓结樀脑O(shè)計(jì)合成與應(yīng)用42-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 2 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-48
• 4 本部分小結(jié)48-49
• 全文總結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 致謝53-54
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的論文目錄54-55

【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：基于對(duì)蛋白質(zhì)色氨酸殘基熒光猝滅的均相親和分析方法及其應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：318130