本文關鍵詞：斑馬魚內毒素炎癥模型建立及中藥抗內毒素炎癥活性篩選研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 內毒素(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分,可直接或間接引起機體發(fā)熱、代謝改變、免疫功能紊亂,多器官功能損害、休克乃至死亡等許多病理生理過程。目前針對由內毒素觸發(fā)的全身炎癥反應綜合征或膿毒癥的治療尚無特殊有效的措施,仍以糖皮質激素加對癥治療為主,尋找拮抗內毒素的措施一直是基礎醫(yī)學與臨床醫(yī)學努力的方向。近十幾年來,從中藥及天然產物中尋找抗內毒素方法亦為關注的熱點,一些中藥、復方或其所含成分被證明對受內毒素攻擊的動物有保護作用。涼膈散(載宋《和劑局方》)作為溫病治療常用名方,主要用于治療感染、炎癥等。方中重用連翹,清熱解毒,以清除上焦無形之邪熱,功專量重,是為君藥。配黃芩以清胸膈郁熱：大黃瀉火通便,以蕩有形之熱于中,共為臣藥�，F(xiàn)代藥理研究亦證實組成該方的主要單味藥連翹、大黃、黃芩等都有不同程度的抗內毒素作用。 目前,對急癥醫(yī)學、抗炎免疫藥物研發(fā)顯得尤為重要的是尋找合適的動物模型進行抗內毒素藥物篩選。而斑馬魚對此具有豐富的前景：體小,產卵量高,繁殖周期短,成本低；體外受精,發(fā)育全程透明,可實時觀察病原體和損傷。此外,斑馬魚屬于脊椎動物,其免疫系統(tǒng)與人類極為相似。斑馬魚作為理想的抗內毒素炎癥藥物篩選模型主要在于擁有先進的基因技術和大量的轉基因系。比如,利用Tg(mpo:GFP)系可實時活體觀測幼魚中性粒細胞的生物學行為。這是其它脊椎動物所無法實現(xiàn)的。 本文為國家自然科學基金“涼膈散對內毒素急性肺損傷肺組織水液轉運的影響及機制研究”和廣州市科技計劃項目“涼膈解毒膠囊臨床前藥理及抗內毒素藥效評價關鍵技術研究”的部分研究工作。在前述相關研究基礎上,發(fā)揮斑馬魚在抗炎免疫藥理研究及藥物篩選方面的特色與優(yōu)勢,建立方便、快捷的中藥抗內毒素活性篩選體系,并利用該體系對涼膈散方中部分成分的抗內毒素活性進行篩選,從轉基因系、細胞化學水平、基因水平揭示該方抗內毒素作用的物質基礎。 研究目的與意義 目的：建立斑馬魚內毒素炎癥模型,探討中藥抗內毒素炎癥活性篩選新方法,并在此基礎上研究涼膈散方中活性成分連翹酯苷A、連翹苷、大黃素、黃芩苷對斑馬魚內毒素炎癥模型的保護作用。意義：構建斑馬魚內毒素炎癥模型,為研究人類炎癥免疫疾病相關的病理生理機制及在活體內進行快速藥物篩選提供新的技術平臺；利用馬魚內毒素炎癥模型,建立一個介于體外初篩與哺乳動物驗證之間的快速、低成本的中藥抗內毒素活性篩選新方法,具有良好應用前景。 研究方法 1.脂多糖(LPS)誘導斑馬魚炎癥模型的構建 1.1.LPS染毒方式選擇不同方式(浸泡、顯微注射)同樣給予相同濃度LPS,觀察炎癥表型變化；經中性紅染色、蘇丹黑B染色觀察巨噬細胞、中性粒炎癥遷移聚集情況；使用中性粒細胞轉基因斑馬魚(mpo:GFP),結合活體成像系統(tǒng)實時監(jiān)測中性粒細胞炎癥遷移過程；觀察熒光下炎癥表型變化,統(tǒng)計存活情況,比較死亡率和生存時間(Kaplan-Meier曲線法)。 1.2.LPS染毒時間(魚齡)選擇將不同發(fā)育時期的幼魚(3天、5天、6天)顯微注射相同濃度LPS,統(tǒng)計存活情況,比較死亡率和生存時間(Kaplan-Meier曲線法)。 1.3.LPS染毒劑量選擇將不同濃度的LPS (0.5,0.4,0.25mg/ml)顯微注射到一定時期的幼魚中,統(tǒng)計存活情況,比較死亡率和生存時間(Kaplan-Meier曲線法)。在此基礎上進行半數(shù)致死濃度LD5o的測定。 2.基于斑馬魚內毒素炎癥模型的抗內毒素中藥活性篩選及其藥效評價方法研究——連翹酯苷A、連翹苷、大黃素、黃芩苷對斑馬魚內毒素炎癥模型的保護作用 將3dpf隨機分為陰性對照組(PBS)、LPS組、LPS+3個不同劑量連翹酯苷A組(LPS+FA)、LPS+3個不同劑量連翹苷組(LPS+PHN)、LPS+3個不同劑量大黃素組(LPS+EDN)、LPS+3個不同劑量黃芩苷組(LPS+BAN)、地塞米松陽性對照(LPS+DEX)。造模后,各單體以浸泡給藥方式進行抗炎活性篩選及其藥效評價：用Kaplan-Meier曲線法分析各用藥組對斑馬魚存活率及生存時間的影響,據(jù)此確定給藥濃度后,重點觀察給藥后不同時間點的白細胞聚集程度(轉基因系Tg(coro la:GFP;lyz:Dsred)或Tg(mpo-GFP)示蹤)、中性粒細胞數(shù)量(蘇丹黑B染色后進行中性粒細胞計數(shù))及促炎介質TNF-α IL-1β\IL-6的表達(RT-PCR法)。 主要研究結果 1.LPS誘導斑馬魚炎癥模型的構建 1.1.染毒方式選擇 我們采用顯微注射LPS到3天受精卵(days post-fertilization, dpf)的卵黃囊中(每組34條魚),發(fā)現(xiàn)注射0.5mg/ml LPS (2nl每條魚)24h后能導致嚴重的畸形：卵黃壞死(22.0±0.9%)、脊椎彎曲(30.7±0.2%)、心包水腫(4.6±0.5%)、心胞膜出血(12.6±0.5%)、死亡(34.0±1.5%),其中卵黃壞死、死亡是其嚴重感染的表型,且隨著觀察時間延長,幼魚的感染更嚴重。相反,0.5mg/ml LPS浸泡組在24h內沒觀察到任何異常表型。 中性紅和蘇丹黑B染色結果顯示,LPS浸泡組無明顯的巨噬細胞和中性粒細胞聚集區(qū),出現(xiàn)聚集的斑馬魚數(shù)分別占總觀察數(shù)的0%和3.3%；而LPS顯微注射組在注射位點卵黃囊上可觀察到巨噬細胞和中性粒細胞大量聚集,出現(xiàn)聚集的斑馬魚數(shù)分別占總觀察數(shù)的96.6%和95.5%。這兩種炎細胞在各實驗組中的聚集率在統(tǒng)計學上有顯著性差異(P0.00001)。 用Tg(mpo:GFP)斑馬魚示蹤中性粒細胞發(fā)現(xiàn),LPS卵黃注射組和PBS對照組在注射2h后可觀察到中性粒細胞局部彌散在卵黃囊上；6h后PBS對照組卵黃囊上的中性粒細胞開始退回血管；而LPS卵黃注射組則成團停滯在卵黃囊上；12-16h卵黃囊上中性粒細胞成團停滯的部位變?yōu)橐粋�邊界清晰熒光圈；18-24h卵黃囊糜爛,mpo全身信號漸弱,開始出現(xiàn)死亡。相反,LPS浸泡組在48h內沒觀察到中性粒細胞異常遷移行為。 生存分析結果顯示,卵黃囊顯微注射LPS在32h內對斑馬魚的致死率100%,大部分在24h內出現(xiàn)明顯的中毒表型。浸泡LPS組無明顯中毒表型,45h存活率為100%；48h存活率為85.6%,剩余幼魚直到實驗結束還存活。而卵黃顯微注射PBS和正常對照組在48h存活率分別為94.4%,100%。LPS卵黃顯微注射組的斑馬魚存活率和生存時間顯著低于LPS浸泡組(P0.0001)。 1.2.LPS染毒時間(魚齡)選擇 3dpf在注射LPS后32h內致死率為100%,5dpf、6dpf在48h內致死率均為94%,剩余幼魚直到實驗結束還存活。而PBS對照存活率為100%。3dpf、5dpf、6dpf的中位生存時間分別為20、25、36h,3種注射時間的生存時間有顯著性差異P0.001)。 1.3.LPS染毒劑量選擇 隨著注射LPS濃度降低,實驗組內胚胎致死率也隨之下降,呈劑量依賴性。LPS半數(shù)致死濃度LDso為297.61μg/ml(95%可信區(qū)間為287.711-307.331)；致死濃度LD99為542.641μg/ml(95%可信區(qū)間為503.377-598.246)。 2.基于斑馬魚內毒素炎癥模型的抗內毒素中藥活性篩選及其藥效評價方法研究——連翹酯苷A、連翹苷、大黃素、黃芩苷對斑馬魚內毒素炎癥模型的保護作用 2.1.各單體給藥組對LPS感染的斑馬魚存活率的影響 與LPS模型組相比,經2,4,8μg/ml連翹酯苷A、1,3.3,10μg/ml連翹苷、0.055,0.11,0.22μg/ml大黃素、1.25,2.5,5μg/ml黃芩苷治療均能明顯延長斑馬魚生存時間,提高存活率(均有P0.001),且存在劑量依賴性。其中以8μg/ml連翹酯苷A,10μg/ml連翹苷,5μg/ml黃芩苷藥效較明顯,從存活率及生存時間兩方面均優(yōu)于其它濃度治療組(分別與另兩個濃度組相比,均有P0.05)。與另兩個濃度組相比,0.22μg/ml大黃素雖有較高的存活率和明顯延長的生存時間,但僅與0.055μg/ml存在顯著性差異(P0.05),與0.11μ/ml大黃素不存顯著性差異(P0.05)。據(jù)此,我們以8μg/ml連翹酯苷A,10μg/ml連翹苷,0.22μg/ml大黃素,5μg/ml黃芩苷,5μg/ml地塞米松作為浸泡給藥濃度。 2.2.各單體給藥組對不同時間點的白細胞炎癥聚集和組織壞死的影響 利用轉基因系或蘇丹黑B染色觀察發(fā)現(xiàn),與白細胞明顯募集卵黃注射位點的LPS組相比(3度炎癥募集為主,無壞死),在注射6h后PBS陰性對照組,地塞米松,8μg/ml連翹酯苷A,10μg/ml連翹苷,0.22μg/ml大黃素,5μg/ml黃芩苷的白細胞只有少量零散分布(1-2度炎癥募集,無壞死)。注射后12h,PBS陰性對照組與正常對照組相似,注射位點——卵黃上無或只有少數(shù)幾個炎細胞募集(1度炎癥募集,無壞死),除LPS組中白細胞大量募集卵黃外(4度炎癥募集為主,出現(xiàn)少量壞死),各單體治療組卵黃只有少量白細胞零散分布(2度炎癥募集為主)。隨著時間增加LPS組感染程度明顯加重,24h后LPS組中幾乎所有魚卵黃都呈現(xiàn)出畸形和大面積壞死(5度炎癥募集為主,嚴重壞死),各單體治療組白細胞募集雖有所增多,但注射位點沒出現(xiàn)壞死或只有個別魚卵黃注射位點出現(xiàn)小面積壞死(3,4度炎癥募集為主)。 2.3.各單體給藥組對不同時間點的中性粒細胞產生和遷移的影響 對于PBS對照組,卵黃囊中性粒細胞數(shù)在注射后6h達峰后開始減少,12、24h卵黃上幾無中性粒細胞；而腹主動脈中性粒細胞數(shù)于注射后6h開始增加,且總體中性粒細胞數(shù)在3h后一直保持穩(wěn)定數(shù)量。與PBS對照相比,注射LPS后1、3、6、12h斑馬魚總體中性粒細胞數(shù)量大量增加(n=10,P0.001)；其中腹主動脈中性粒細胞在1、3h大量產生后于6、12h逐漸減少；卵黃囊的中性粒細胞數(shù)在1、3、6隨時間推移不斷增加(均有P0.001),6h達高峰后數(shù)量開始下降,但12h時不管是總體數(shù)量還是卵黃中的數(shù)量仍高于PBS組(均有P0.001)。24h后LPS組中卵黃囊注射位點可見明顯畸形和壞死,總體中性粒細胞數(shù)、卵黃囊的中性粒細胞數(shù)及腹主動脈的中性粒細胞數(shù)均出現(xiàn)急劇減少(均有P0.001)。在感染的早期(1-12h),10μg/ml連翹苷,8μg/ml連翹酯苷A,0.22μg/ml大黃素,5μg/ml黃芩苷治療組對LPS所致的中性粒細胞大量產生,激活及炎性遷移均有明顯的抑制作用(均有P0.05)。在感染的晚期(24h),各單體治療組均能明顯抑制中性粒細胞的大量減少和組織壞死(均有P0.05)。 2.4.各單體給藥組對不同時間點的促炎介質TNF-α、IL-1β、IL-6的表達的影響 注射后6-24h,與PBS組相比,LPS感染的斑馬魚其IL-1β,IL-6和TNF表達均顯著增加(P0.05)。IL-1β對LPS感染呈現(xiàn)出速發(fā)型應答,6hpi已高于PBS對照組13倍,18hpi達最高值30倍。LPS組的IL-6表達情況與IL-1β相似,不同的是IL-6隨著時間增加表達量不斷增加,最高值時間在24hpi。對于TNF-α,其表達水平在這幾個時間點上上調幅度不如IL-1β和IL-6大,但各時間點仍明顯高于PBS組。在6-18h內,各單體治療組均能明顯抑制LPS介導的TNF-α,IL-1β,IL-6表達上調(均有P0.05),而在注射后24h則只觀察到對IL-6增加仍有抑制作用。 結論 1.選擇3dpf斑馬魚,以0.5mg/mlLPS濃度,采用卵黃顯微注射染毒方式,可作為建立炎癥模型的參考條件；在顯微鏡下實時活體觀察LPS誘導的白細胞的遷移聚集情況、斑馬魚死亡率、生存時間可作為篩選抗內毒素炎癥活性參考指標。 2.涼膈散方中活性成分連翹酯苷A、連翹苷、大黃素、黃芩苷均有抗內毒素炎癥作用。其作用機制可能與抑制LPS激活巨噬細胞和中性粒細胞而減少白細胞的產生及炎性遷移,抑制促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達,從而調控急性炎癥反應的進程有關。連翹苷、連翹酯苷A、大黃素、黃芩苷可作為進一步研究的抗內毒素疾病候選藥物。
【關鍵詞】：斑馬魚 內毒素 連翹苷 連翹酯苷A 大黃素 黃芩苷
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R284
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 第一章 前言21-28
• 1.1 內毒素生物效應及抗內毒素治療研究概況21-22
• 1.2 斑馬魚研究概況及在抗內毒素中藥篩選中的優(yōu)勢22-27
• 1.3 本文主要研究工作及意義27-28
• 第二章 斑馬魚內毒素炎癥模型構建28-48
• 2.1 材料與方法28-31
• 2.2 實驗結果31-46
• 2.3 討論46-47
• 2.4 本章小結47-48
• 第三章 基于斑馬魚內毒素炎癥模型的抗內毒素中藥活性篩選及其藥效評價方法研究48-84
• 3.1 連翹酯苷A對斑馬魚內毒素炎癥模型的保護作用48-64
• 3.2 連翹苷對斑馬魚內毒素炎癥模型的保護作用64-74
• 3.3 大黃素、黃芩苷對斑馬魚內毒素炎癥模型的保護作用74-82
• 3.4 本章小結82-84
• 結語84-86
• 附錄86-88
• 參考文獻88-96
• 成果96-97
• 致謝97-98

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