目的利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)在NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系中敲除Asxl2基因。方法設(shè)計(jì)一對(duì)靶向小鼠Asxl2基因第5個(gè)外顯子的小向?qū)NA（sg RNA）,分別克隆進(jìn)p X462載體。將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞中,利用有限稀釋法得到單細(xì)胞,通過培養(yǎng)獲得單克隆細(xì)胞系。提取單克隆細(xì)胞系基因組DNA,ge-notyping PCR擴(kuò)增出靶位點(diǎn)附近的DNA片段并測(cè)序。利用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞株中Asxl2的敲除效果。結(jié)果成功構(gòu)建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重組質(zhì)粒。將2個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,嘌呤霉素篩選后得到亞克隆細(xì)胞系,并且經(jīng)genotyping PCR測(cè)序驗(yàn)證得到一株正確的單克隆細(xì)胞系。Western blot證實(shí)敲除Asxl2后,該NIH3T3細(xì)胞系中Asxl2蛋白表達(dá)缺失。結(jié)論通過這個(gè)系統(tǒng)得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重組質(zhì)粒及穩(wěn)定敲除Asxl2的NIH3T3細(xì)胞系。 

【文章來源】：天津醫(yī)藥. 2015,43(10)

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1材料與方法
2結(jié)果
3討論



本文編號(hào)：3137047