RNAⅢ分子是調(diào)控金黃色葡萄球菌毒力因子表達(dá)的關(guān)鍵分子。最新的研究認(rèn)為，金葡菌分泌的RAP（RNAⅢ activating protein）能磷酸化其靶蛋白TRAP，從而激活RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄。但是目前對RAP尚存在爭議，因而RAP-TRAP通路仍需詳盡的研究。參照文獻(xiàn)報道的方法，我們實驗室從金葡菌的培養(yǎng)上清中初步純化到了能夠激活RNAⅢ轉(zhuǎn)錄的成分（RAP樣蛋白），以這些粗純成分為靶，從噬菌體隨機(jī)展示肽庫中篩選到了具有抑制RNAⅢ轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)合肽序列R15。另外生物質(zhì)譜鑒定了其中的蛋白條帶。本課題的目的是在以上工作的基礎(chǔ)上對RAP-TRAP毒力調(diào)節(jié)通路進(jìn)行深入的研究。本研究首先利用大腸桿菌分別表達(dá)了生物質(zhì)譜鑒定出的Beta-溶血素和PV白細(xì)胞毒素S蛋白（均去除了信號肽部分）。Northern Blot證實表達(dá)的這兩種蛋白均不具有RNAⅢ激活活性。截留金葡菌培養(yǎng)上清，證實確實存在大于10kD的RNAⅢ激活成分�？赡苁荝AP特殊的理化特性而使得對它的鑒定成為研究的瓶頸。接著，我們對作用肯定的TRAP蛋白進(jìn)行了深入探討，包括TRAP蛋白的細(xì)胞定位和TRAP細(xì)胞外結(jié)合蛋白的釣取、鑒定。與生物信息學(xué)... 

【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

重組載體構(gòu)建策略圖

分別以提取的04018基因組DNA和RN639OB基因組DNA為模板，以介成的beta一溶血素基因_一匕下游引物，利用高保真的pfu聚和酶進(jìn)行PcR:，將PcR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳圖譜顯示PcR產(chǎn)物均為單一條帶，分子量為90obp左右(圖1.2)，與預(yù)期相同。圖1.2以金葡菌基因組為模板PCR擴(kuò)增beta一溶血素基因電泳圖1:04018基因組為模板的PCR產(chǎn)物2:RN6390B基因組模板的PCR產(chǎn)物1.3.2.3重組質(zhì)粒的鑒定回收PCR產(chǎn)物，37℃雙酶切過夜，回收酶切后的產(chǎn)物，T4DNA連接酶連接目的基因片段與經(jīng)過同樣雙酶切并回收的pET-28a(+)載體部分，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，挑取轉(zhuǎn)化后的3個單個克隆活化，利用引物對菌液直接進(jìn)行PCR鑒定(圖1.3)。提取PCR鑒定陽性菌的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(圖1.4)，可見重組質(zhì)粒的BamHI位點被插入的基因片段缺失掉而使不能線性化

PCR鑒定克隆電泳圖


本文編號：3128289