本文關(guān)鍵詞：探索FtsZ突變體影響E.coli中MreB細(xì)胞定位模式的分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，越來越多的細(xì)菌對(duì)現(xiàn)有抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性。天然抗生素是細(xì)菌產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，被用于對(duì)抗其他微生物以保護(hù)自身安全的化學(xué)物質(zhì)。而微生物接觸到這種物質(zhì)時(shí)對(duì)抗菌藥物的抵抗主要是通過改變自身代謝途徑或產(chǎn)生相應(yīng)的滅活物質(zhì)，，這給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)。開發(fā)新靶點(diǎn)的抗生素迫在眉睫，F(xiàn)tsZ（Filamentous temperature sensitive）是介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞分裂的關(guān)鍵的微管蛋白同系物且與人類微管蛋白序列具有較大的差異性，從而能夠設(shè)計(jì)出選擇性作用于細(xì)菌FtsZ而不干擾宿主細(xì)胞的抑制劑，F(xiàn)tsZ蛋白有希望成為研究抗菌藥物的新靶點(diǎn)。 大腸桿菌有兩個(gè)基本的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)，F(xiàn)tsZ和MreB。FtsZ是高度保守的GTP酶，同源于真核細(xì)胞的微管蛋白。它能夠在細(xì)胞的中間位置形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，主要功能是在質(zhì)體分裂過程中起到支架的作用，并且形成一個(gè)多樣的蛋白質(zhì)復(fù)合體負(fù)責(zé)細(xì)胞的分裂。在細(xì)菌中，F(xiàn)tsZ被認(rèn)為是定位在將要分裂部位的第一種蛋白質(zhì)，在大腸桿菌E.coli中一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)包含F(xiàn)tsZ（Z環(huán)）以及被吸附的其他分裂蛋白所組成，它們?cè)诩?xì)菌細(xì)胞中點(diǎn)位置形成一個(gè)分裂體。這對(duì)于隔膜綜合體的形成以及細(xì)胞分裂是必不可少的。 細(xì)菌細(xì)胞分裂是由微管蛋白類似物FtsZ所控制而細(xì)胞的伸長(zhǎng)是由肌動(dòng)蛋白類似物MreB控制。MreB是一種類似肌動(dòng)蛋白的ATP酶，同時(shí)也是維持大腸桿菌細(xì)胞典型的桿狀和細(xì)胞極性的一種最基本的酶。MreB的功能還涉及染色體的分裂，細(xì)胞器在細(xì)胞膜上的定位以及合成協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂的生物物質(zhì)。因?yàn)镕tsZ和MreB涉及到細(xì)胞一系列基本的功能，所以當(dāng)它們的功能受到抑制時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 一個(gè)動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)主要包括蛋白質(zhì)募集和轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和分裂。細(xì)胞中內(nèi)部程序的協(xié)調(diào)運(yùn)作與肌動(dòng)蛋白和微管蛋白同系物的作用密不可分。在原核生物中，微管蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白的作用主要是調(diào)控肌動(dòng)蛋白并與之相互協(xié)調(diào)。FtsZ和MreB能夠形成大分子結(jié)構(gòu)分別對(duì)于細(xì)胞分裂和細(xì)胞形狀的維持具有重要的意義。但是如何協(xié)調(diào)細(xì)菌的生長(zhǎng)和分裂目前的研究還尚不清楚。所以深入研究細(xì)胞骨架的功能，了解肌動(dòng)蛋白和微管蛋白家族之間的協(xié)調(diào)作用是非常重要的。 有報(bào)道指出，F(xiàn)tsZ和MreB之間直接的相互作用能夠促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞分裂和細(xì)胞增長(zhǎng)。我們利用活細(xì)胞成像技術(shù)，觀察到大腸桿菌的MreB和FtsZ在細(xì)胞內(nèi)的定位模式及共定位現(xiàn)象，通過對(duì)FtsZ的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，我們選擇幾個(gè)重要的氨基酸位點(diǎn)作為突變靶點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)FtsZ的突變體影響了MreB在E.coli中的定位。對(duì)Pull-Down和western blot結(jié)果分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MreB和FtsZ的相互作用是MreB在細(xì)胞內(nèi)螺旋定位的重要條件。本研究結(jié)果有力的證明了負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂的蛋白與負(fù)責(zé)細(xì)胞形態(tài)的蛋白在功能上相互協(xié)調(diào)的重要性，為深入探討細(xì)菌是如何協(xié)調(diào)分裂與生長(zhǎng)及正常形態(tài)維持的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)支持。 目的 1.研究FtsZ和MreB在細(xì)胞內(nèi)的定位模式； 2.FtsZ部分突變體對(duì)MreB在細(xì)胞內(nèi)螺旋定位的影響； 3.FtsZ影響MreB細(xì)胞內(nèi)定位的分子機(jī)制。 方法 1.利用同源重組技術(shù)從大腸桿菌基因組中敲除MreB基因； 2.構(gòu)建不同的質(zhì)粒表達(dá)FtsZ-YFP、YFP-FtsZ、YFP-MreB的融合蛋白，利用熒光顯微鏡研究FtsZ和MreB在細(xì)胞內(nèi)的定位模式； 3.利用重疊PCR構(gòu)建不同的FtsZ突變體，探索大腸桿菌中FtsZ的突變體是否影響MreB的定位以及分子機(jī)制。結(jié)果 1. FtsZ在E. coli中形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)； 2.MreB在E.coli中形成螺旋狀結(jié)構(gòu)； 3.FtsZ與MreB在細(xì)胞內(nèi)相互作用，且在一定的時(shí)相共定位于E.coli相應(yīng)的部位； 4.FtsZ突變體影響MreB熒光定位模式的分子機(jī)制主要是影響了FtsZ-MreB間的相互作用。 結(jié)論 FtsZ與MreB的相互作用是MreB在細(xì)胞內(nèi)螺旋定位的重要條件。
【關(guān)鍵詞】：FtsZ MreB Z環(huán)
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文縮略詞表（ABBREVIATION）11-12
• 前言12-14
• 1 材料、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器14-22
• 1.1 材料14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑15
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備15-16
• 1.4 主要溶液的配制16-22
• 2 方法22-36
• 2.1 載體的構(gòu)建22-26
• 2.1.1 引物設(shè)計(jì)22-23
• 2.1.2 E.coli 基因組 DNA 的制備23
• 2.1.3 PCR 擴(kuò)增 FtsZ 基因23-24
• 2.1.4 DNA 片段膠回收24-25
• 2.1.5 酶切25
• 2.1.6 連接(載體與目的片段的摩爾比為 1:3)25-26
• 2.2 質(zhì)粒的提取26-30
• 2.2.1 制備超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞26
• 2.2.2 CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞26-27
• 2.2.3 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備27-28
• 2.2.4 質(zhì)粒的化學(xué)轉(zhuǎn)化28
• 2.2.5 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化28-29
• 2.2.6 質(zhì)粒的提取29-30
• 2.5 目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)30
• 2.6 細(xì)菌的凍存30
• 2.7 細(xì)菌裂解及菌體蛋白的制備30-31
• 2.8 蛋白質(zhì)凝膠電泳31
• 2.9 蛋白免疫印跡分析31-33
• 2.10 熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡33
• 2.11 PULL DOWN 分析33-36
• 3 結(jié)果36-54
• 3.1 不同細(xì)菌來源的 FTSZ 同源性分析36-38
• 3.2 E.COLI 的 FTSZ 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)38-39
• 3.3 PFL13 表達(dá)載體構(gòu)建39-44
• 3.4 LF6(△MREB)菌株的構(gòu)建44-48
• 3.5 MREB 在 E.COLI 中形成螺旋狀結(jié)構(gòu)48-49
• 3.6 MREB 在 LF6(△MREB)中的定位模式49
• 3.7 FTSZ 在 E.COLI 中形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)49-50
• 3.8 FTSZ 的突變體是否影響 MREB 的定位50-52
• 3.9 FTSZ 是否影響 E. COLI 中 MREB 的熒光定位模式52
• 3.10 FTSZ 與 MREB 在細(xì)胞內(nèi)相互作用，且在一定的時(shí)相共定位于 E.COLI 相應(yīng)的部位52-53
• 3.11 FTSZ 突變體影響 MREB 熒光定位模式的分子機(jī)制主要是影響了 FTSZ-MREB 間的相互作用53-54
• 4 討論54-56
• 結(jié)論56-58
• 參考文獻(xiàn)58-60
• 綜述60-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 致謝68-70

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 曾憲玉;丙酸桿菌的耐藥研究及鹽酸小檗堿對(duì)耐藥株的抑制機(jī)制研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 段晨帆;乙醇對(duì)大鼠原代大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及Plk2表達(dá)的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

2 王元澤;作用于FtsZ蛋白PC位點(diǎn)的新型3-MBA衍生物的合成及抗菌活性研究[D];山東大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：探索FtsZ突變體影響E.coli中MreB細(xì)胞定位模式的分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：312544