目的:探討人巨細(xì)胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗體的制備及鑒定方法。方法:HCMV US31基因經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表達(dá)載體,構(gòu)建pET21a（+）/HCMV US31重組質(zhì)粒,測(cè)序鑒定;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),Ni-NTA親和層析法純化US31蛋白,免疫新西蘭兔制備多克隆抗體,ELISA、Western blot及免疫熒光方法檢測(cè)抗體效價(jià)和特異性。結(jié)果:在大腸桿菌中誘導(dǎo)出高表達(dá)的HCMV US31融合蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和純化后獲得高純度的目的蛋白;免疫新西蘭兔誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的IgG抗體,效價(jià)為1:49 600;經(jīng)ELISA、Western blot以及免疫熒光均證實(shí)制備的特異性抗體可識(shí)別細(xì)胞中表達(dá)的US31蛋白。結(jié)論:成功制備了HCMV US31蛋白及特異性抗體,為進(jìn)一步研究US31蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019,49(08)

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

HCMVUS31原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定250bp100bp

巖?；4：10 mmol/L咪唑洗脫液；5：50 mmol/L咪唑洗脫液；6：100 mmol/L咪唑洗脫液；7：200 mmol/L咪唑洗脫液；8：500 mmol/L咪唑洗脫液；9：過(guò)柱平衡液洗脫液2圖2 pUS31蛋白原核表達(dá)和純化鑒定圖A：不同免疫時(shí)間點(diǎn)US31蛋白血清抗體反應(yīng)檢測(cè)，血清稀釋比為1:100；B：免疫6周兔血清US31蛋白特異性抗體效價(jià)檢測(cè)圖3 HCMV US31特異性抗體效價(jià)分析A：Western blot檢測(cè)US31蛋白表達(dá)，一抗采用本次研究制備的US31兔多克隆抗體（1:5 000），二抗采用聯(lián)科生物的羊抗兔抗體（1:1 000）；B：免疫熒光檢測(cè)HCMV US31的表達(dá)（× 200）圖4 US31特異性抗體檢測(cè)HEK293T細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)第0周OD450OD450第2周第4周稀釋度時(shí)間第6周1:401:1601:6401:25601:102401:409601:1638402.02.0pUS31組PBS組pUS31組PBS組1.51.51.01.00.50.500US31DAPIMergeAd-US31ControlUS31ABAd-US31ControlGAPDHtrol組轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞作用時(shí)，Control組病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見(jiàn)紅色熒光，Ad-US31組轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞可見(jiàn)紅色熒光，且大部分位于細(xì)胞核周，見(jiàn)圖4B。3討論當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，潛伏感染的HCMV被激活，常導(dǎo)致移植失敗、HCMV肺炎、肝炎甚至死亡等

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3125002