目的:探討人巨細胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗體的制備及鑒定方法。方法:HCMV US31基因經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后進行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表達載體,構(gòu)建pET21a（+）/HCMV US31重組質(zhì)粒,測序鑒定;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達,Ni-NTA親和層析法純化US31蛋白,免疫新西蘭兔制備多克隆抗體,ELISA、Western blot及免疫熒光方法檢測抗體效價和特異性。結(jié)果:在大腸桿菌中誘導(dǎo)出高表達的HCMV US31融合蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和純化后獲得高純度的目的蛋白;免疫新西蘭兔誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的IgG抗體,效價為1:49 600;經(jīng)ELISA、Western blot以及免疫熒光均證實制備的特異性抗體可識別細胞中表達的US31蛋白。結(jié)論:成功制備了HCMV US31蛋白及特異性抗體,為進一步研究US31蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2019,49(08)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

HCMVUS31原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定250bp100bp

巖?；4：10 mmol/L咪唑洗脫液；5：50 mmol/L咪唑洗脫液；6：100 mmol/L咪唑洗脫液；7：200 mmol/L咪唑洗脫液；8：500 mmol/L咪唑洗脫液；9：過柱平衡液洗脫液2圖2 pUS31蛋白原核表達和純化鑒定圖A：不同免疫時間點US31蛋白血清抗體反應(yīng)檢測，血清稀釋比為1:100；B：免疫6周兔血清US31蛋白特異性抗體效價檢測圖3 HCMV US31特異性抗體效價分析A：Western blot檢測US31蛋白表達，一抗采用本次研究制備的US31兔多克隆抗體（1:5 000），二抗采用聯(lián)科生物的羊抗兔抗體（1:1 000）；B：免疫熒光檢測HCMV US31的表達（× 200）圖4 US31特異性抗體檢測HEK293T細胞中目的蛋白的表達第0周OD450OD450第2周第4周稀釋度時間第6周1:401:1601:6401:25601:102401:409601:1638402.02.0pUS31組PBS組pUS31組PBS組1.51.51.01.00.50.500US31DAPIMergeAd-US31ControlUS31ABAd-US31ControlGAPDHtrol組轉(zhuǎn)染的293T細胞作用時，Control組病毒轉(zhuǎn)染的細胞未見紅色熒光，Ad-US31組轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞可見紅色熒光，且大部分位于細胞核周，見圖4B。3討論當(dāng)機體免疫力低下時，潛伏感染的HCMV被激活，常導(dǎo)致移植失敗、HCMV肺炎、肝炎甚至死亡等

【參考文獻】：
期刊論文
[1]福氏志賀菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗體的制備和鑒定[J]. 王羽,廖翔,岳俊杰,周圍,梁龍,呼和巴特爾.  細胞與分子免疫學(xué)雜志. 2014(04)
[2]人巨細胞病毒AD169株UL115基因編碼gL蛋白序列分析及B細胞表位預(yù)測[J]. 魏中南,胡洪波,彭巧英.  臨床血液學(xué)雜志(輸血與檢驗版). 2012(04)
[3]EBV LMP1和CMVpp65在腎臟疾病腎組織中的表達[J]. 余曉霞,劉華鋒,陳孝文,陶靜莉,楊陳,李尚妹.  臨床與實驗病理學(xué)雜志. 2011(03)
[4]HCMV基因及其產(chǎn)物在感染中的作用[J]. 李建蓉,黃漢菊.  國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊. 2005(06)

碩士論文
[1]高危人群HCMV和BKV感染情況的調(diào)查及其與腎病關(guān)系的研究[D]. 何雨.廣西醫(yī)科大學(xué) 2010



本文編號：3125002