本文關鍵詞：anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡相關基因的差異表達及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：anisomycin作為一種蛋白合成抑制劑可以誘導多種細胞發(fā)生凋亡，此前本課題組已發(fā)現(xiàn)anisomycin能抑制人類急性T淋巴細胞性白血病(Jurkat T)細胞增殖、阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡，JNK信號通路的活化與anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡有關，miRNA let-7c可能參與JNK信號通路的活化介導JurkatT細胞凋亡，顯示其應用于T淋巴細胞性白血病臨床治療的潛在可能性。因此，探明anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡的機制具有重要的科學意義。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞存在諸多與細胞凋亡相關的基因，在anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡過程中究竟有哪些細胞凋亡相關基因參與？它們是否與JNK/miRNAlet-7c關聯(lián)？本研究利用qPCR基因芯片技術首次比較系統(tǒng)地分析了anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡相關基因的的差異性表達譜，以期進一步闡明anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡的機制，為其臨床應用奠定一定基礎。 目的：通過qPCR基因芯片技術篩選anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡相關基因的差異表達譜，確證差異表達基因E2F2是否與anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡有關，E2F2分子與介導anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡的miRNA let-7c之間是否存在關聯(lián)。 方法：鏡下觀察不同濃度anisomycin處理組Jurkat T細胞形成集落的大小和數量；熒光顯微鏡下觀察不同濃度anisomycin處理后Jurkat T細胞核染色質形態(tài)的變化；流式細胞術分析不同濃度anisomycin作用下Jurkat T細胞的凋亡率；qPCR基因芯片從88種細胞凋亡相關基因中篩選anisomycin作用后差異表達顯著的13個基因；RT-PCR和qPCR在mRNA水平驗證篩選出顯著差異表達的基因，從中選出感興趣的E2F2以確定其作用。轉染miRNA let-7c模擬物和miRNAlet-7c抑制劑至Jurkat T細胞中，流式細胞術檢測細胞凋亡率，qPCR和WesternBlot分別在基因和蛋白水平檢測miRNA let-7c和E2F2的含量變化以證實miRNAlet-7c和E2F2與Jurkat T細胞凋亡是否有關；轉染E2F2siRNA至Jurkat T細胞中，流式細胞術檢測細胞凋亡率，qPCR和Western Blot分別在基因水平和蛋白水平檢測let-7c和E2F2的含量變化以進一步確證E2F2與miRNA let-7c介導anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡是否關聯(lián)。* 結果：隨著anisomycin濃度的升高，Jurkat T細胞集落變小和數量減少；JurkatT細胞核皺縮，凋亡小體形成，凋亡細胞百分比與anisomycin的濃度成依賴性遞增。qPCR基因芯片分析顯示，anisomycin處理Jurkat T細胞1h后，AIFM2、CAS5、CD226、CD27、CIDEA、DAPK2、EGFR、ERBB3、FADD、FASLG、IFNA2、IFNB1、IGF1、IGF1R、IKBKG、IL10、IL1A、IL1B、IL6R、IL7、MAP3K1、MAP3K10、 MAP3K14、 NTRK1、 PDCD1、 PPP3CC、 STAT1、 STAT5B和TNFRSF10A共29個基因表達上調，AKT2、AKT3、CAS4、CD24、E2F2、EndoG、IKBKB、IL4、MAP3K5、PIK3R2、TNF和TNFRSF10B共12個基因表達下調，，其中，CD226、FADD和IL1B上調高達20~45倍，AKT2、CD24、E2F2、EndoG、IL4和PIK3R2基因下調10~20倍。anisomycin處理Jurkat T細胞6h后，APAF1、API5、CAS7、CAS9、CD226、CD27、E2F2、ERBB3、IFNB1、IGF1R、IL2、RIPK1、STAT1、TNFRSF10A和XIAP15個基因表達上調，DAPK3、FASLG、IKBKG、IL6R和IRAK15個基因表達下調，其中，CAS7、CAS9、CD226、IL2和TNFRSF10A5個基因上調達10~20倍，而FASLG和IL6R下調均達15倍左右。篩選出差異倍數10倍以上的13個基因，即CD226、CD24、E2F2、FASLG、TNFRSF10A、CAS7、CAS9、PIK3R2、IKBKB、AKT2、AKT3、FADD和EndoG，qPCR顯示E2F2、PIK3R2、IKBKB、CD24、CAS9、CD226和TNFRSF10A7基因的qPCR結果與芯片的結果一致。miRNA let-7c可以促進Jurkat T細胞的凋亡，qPCR和Western Blot顯示miRNAlet-7c增加E2F2的水平；敲低E2F2基因可以抑制細胞凋亡，并一定程度促進let-7c的基因表達。 結論：anisomycin能誘導Jurkat T細胞明顯凋亡，可能與E2F2、PIK3R2、CD24、IKBKB、CAS9、CD226和TNFRSF10A有關；E2F2在anisomycin誘導Jukat T細胞凋亡過程中與miRNA let-7c相關聯(lián)。這些結果有助于進一步闡明anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡的機制。
【關鍵詞】：anisomycin 基因芯片 篩選 E2F2 miRNA let-7c 凋亡 Jurkat T
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 前言11-29
• 1 腫瘤的發(fā)生機制11-13
• 1.1 細胞周期檢驗點與腫瘤發(fā)生的關系11-12
• 1.2 細胞凋亡與腫瘤發(fā)生的關系12-13
• 1.3 自噬與腫瘤發(fā)生的關系13
• 2 細胞凋亡機制13-17
• 2.1 細胞表面凋亡受體 Fas 介導的細胞凋亡14-15
• 2.2 線粒體途徑介導的細胞凋亡15-16
• 2.3 細胞凋亡相關因子16-17
• 3 anisomycin 的抗腫瘤作用17-18
• 4 qPCR 基因芯片技術18-19
• 5 細胞凋亡相關基因19-27
• 5.1 CD22619-20
• 5.2 CD2420
• 5.3 E2F220-21
• 5.4 TNFRSF10A21-22
• 5.5 Endonuclease G22
• 5.6 AKT 家族22-23
• 5.7 Caspase 家族23-24
• 5.8 FADD24-25
• 5.9 FASLG25-26
• 5.10 IKBKB26
• 5.11 PIK3R226-27
• 6 研究思路與目的27-29
• 材料與方法29-50
• 1 細胞株29
• 2 試劑29-31
• 3 主要儀器31-32
• 4 主要溶液的配制32-35
• 5 細胞培養(yǎng)35
• 6 集落的觀察35
• 7 Hoechst 染色35-36
• 8 Annexin V / PI 雙染色36
• 9 PCR Array36-42
• 9.1 提取細胞總 RNA36-37
• 9.2 RNA 樣品的完整性、濃度和純度的檢測37
• 9.3 逆轉錄37-38
• 9.4 PCR Array 實時定量 PCR 檢測38-39
• 9.5 RT-PCR39-42
• 9.5.1 細胞總 RNA 的提取39
• 9.5.2 RT39-40
• 9.5.3 PCR40-42
• 9.6 實時定量 PCR42
• 10 Western Blot42-44
• 10.1 細胞胞漿蛋白的提取42-43
• 10.2 電泳43
• 10.3 轉膜43
• 10.4 封閉、抗體結合與顯色43-44
• 11 miRNA let-7c 的應用44-47
• 11.1 細胞處理及轉染44-45
• 11.2 Annexin V/PI 雙染色45
• 11.3 qPCR45
• 11.4 Western Blot45-46
• 11.5 ELISA46-47
• 12 E2F2 siRNA 的應用47-49
• 12.1 細胞處理及轉染47
• 12.2 Annexin V/PI 雙染色47-48
• 12.3 qPCR48
• 12.4 Western Blot48-49
• 12.4.1 細胞內核蛋白的提取48-49
• 12.5 ELISA49
• 13 統(tǒng)計學分析49-50
• 結果50-72
• 1 anisomycin 抑制 Jurat T 細胞集落形成的影響50
• 2 anisomycin 對 Jurkat T 細胞核邊集的影響50-51
• 3 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡51-52
• 4 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡相關基因差異表達的篩選52-57
• 5 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡基因差異表達的鑒定57-62
• 6 miRNA let-7c 在 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡中的作用62
• 7 miRNA let-7c 對 Jurkat T 細胞內 E2F2 的影響62-66
• 7.1 miRNA let-7c 對 Jurkat T 細胞 E2F2 mRNA 水平的影響62-65
• 7.2 miRNA let-7c 對 Jurkat T 細胞 E2F2 蛋白水平的影響65-66
• 8 miRNA let-7c 對 Jurkat T 細胞分泌細胞因子的影響66-67
• 9 E2F2 siRNA 在 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡中的作用67-69
• 9.1 E2F2 siRNA 對 Jurkat T 細胞 E2F2 蛋白水平的影響67
• 9.2 E2F2 siRNA 對 Jurkat T 細胞凋亡的影響67-69
• 10 E2F2 siRNA 對 Jurkat T 細胞內 miRNA let-7c 的影響69-71
• 10.1 Jurkat T 細胞中 miRNA let-7c 在基因水平的半定量變化69
• 10.2 E2F2 siRNA 對 Jurkat T 細胞 miRNA let-7c mRNA 的定量影響69-71
• 11 anisomycin 對 Jurkat T 細胞分泌細胞因子的影響71-72
• 討論72-78
• 1 凋亡相關基因差異表達譜的分析72-74
• 2 miRNA let-7c 在 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡中的作用74-75
• 3 E2F2 在 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡中的作用75-76
• 4 miRNA let-7c 與 E2F2 之間存在的可能關系76-78
• 小結78-79
• 參考文獻79-86
• 發(fā)表論文86-87
• 致謝87-88
• 英文縮略詞表88

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 Daniele Baiz;Barbara Dapas;Rossella Farra;Bruna Scaggiante;Gabriele Pozzato;Fabrizio Zanconati;Nicola Fiotti;Lara Consoloni;Sara Chiaretti;Gabriele Grassi;;Bortezomib effect on E2F and cyclin family members in human hepatocellular carcinoma cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2014年03期

  本文關鍵詞：anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡相關基因的差異表達及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：311000